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      花生維生素E合成相關(guān)基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐鹽性中的應(yīng)用

      文檔序號:8454089閱讀:739來源:國知局
      花生維生素E合成相關(guān)基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐鹽性中的應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及花生維生素E合成相關(guān)基因APG1、提高植物α生育酚含量和耐鹽性中的應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002]維生素E是一種脂溶性的小分子抗氧化劑,分為生育酚和生育三烯酚兩類,各包括α-、β-、γ-和δ-四種類型,其中以α-生育酚的活性最高,可以被人和動物高效吸收和利用。維生素E具有酚氧基結(jié)構(gòu),在植物光合組織中可使逆境脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基失活,并通過與膜脂水解產(chǎn)物形成復合物,清除類囊體膜上的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,阻止膜脂過氧化的擴大,保護膜的完整性,從而增強植株的抗逆境脅迫能力。在非光合組織中,維生素E能淬滅并能同單線態(tài)氧反應(yīng),保護不飽和脂質(zhì)免受單線態(tài)氧損傷;還可以被超氧陰離子自由基氧化,使不飽和油脂免受自由基攻擊,從而抑制油脂的自動氧化,延長油脂的貯存期。另外維生素E還具有調(diào)節(jié)脂肪酸合成、糖類運輸、茉莉酸和乙烯信號轉(zhuǎn)導,促進種子萌發(fā)等功能。
      [0003]維生素E主要在高等植物的葉綠體內(nèi)膜上合成,儲存于植物的葉片和種子中,尤其是油料植物的種子。維生素E合成的第一步是前體一尿黑酸(HGA)和植基二磷酸(PDP)的合成。第二步是HGA與TOP的縮合,它由尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶(HPT)催化,生成2-甲基-6-植基-1,4-苯醌(MPBQ)。第三步是MPBQ在2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成2,3-甲基-5-植基-1,4-苯醌,后者由生育酚環(huán)化酶(TC)和γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ -ΤΜΤ)催化形成γ -和α -生育酚;MPBQ也可由TC和γ -TMT直接催化形成δ_和0_生育酸。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0004]本發(fā)明提供了花生維生素E合成相關(guān)基因APG1、在提高植物α生育酚含量和耐鹽性中的應(yīng)用,本發(fā)明通過將基因轉(zhuǎn)入花生中,可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的維生素E含量和種子的耐鹽性。
      [0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn):
      花生J/^-7基因在提高植物α生育酚含量中的應(yīng)用,所述花生J/^-2基因的序列表如SEQ ID No:1所示,其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
      [0006]進一步的,所述花生J/^-7基因能提高植物的α生育酚含量,轉(zhuǎn)J/^-7基因植株葉片中α生育酚含量達到對照的1.74倍;將花生反義載體進行遺傳轉(zhuǎn)化后明顯減少α生育酚含量,轉(zhuǎn)基因植株葉片中α生育酚含量達對照的20.9%。
      [0007]花生基因在提高植物α生育酚含量中的應(yīng)用,所述花生基因的序列表如SEQ ID No:3所示,其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。
      [0008]進一步的,所述花生基因能提高植物的α生育酚含量,轉(zhuǎn)基因植株葉片中α生育酚含量達到對照的1.34倍;將花生反義載體進行遺傳轉(zhuǎn)化后能明顯減少α生育酚含量,轉(zhuǎn)基因植株葉片中α生育酚含量達對照的13.7%。
      [0009]花生J/^-7基因在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用,所述花生J/^-2基因的序列表如SEQID No:1所示,其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
      [0010]進一步的,所述花生基因受鹽脅迫處理的誘導表達,將花生基因在花生中超量表達,花生轉(zhuǎn)基因種子在0.7% NaCl溶液中發(fā)芽率達到36%,同時轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性增強。
      [0011 ] 花生基因在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用,所述花生AdC因的序列表如SEQID No:3所示,其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。
      [0012]進一步的,所述花生基因受鹽脅迫處理的誘導表達,將花生基因在花生中超量表達,花生轉(zhuǎn)基因種子在0.7% NaCl溶液中發(fā)芽率達到49%,同時轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性增強。
      [0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
      1、本發(fā)明從花生中克隆了 APG-1和基因(測序結(jié)果表明這2個基因均有3個外顯子,分別對應(yīng) J/^-2和的堿基均為 20-610,1125-1428,2262-2422。
      [0014]2、轉(zhuǎn)J/^-7和AdC因花生植株形態(tài)發(fā)育正常,過量表達APG-1和APG-遵M后,轉(zhuǎn)基因花生葉片中α生育酚含量分別可達到295.4和226.5 Pg/g鮮重,分別為對照(169.6 gg/g鮮重)的1.74和1.34倍;而將花生J/^-2和反義載體進行遺傳轉(zhuǎn)化后,轉(zhuǎn)基因植株葉片中α生育酚含量可降低到35.5和23.2 Pg/g鮮重,分別只有對照的20.9%和13.7%。本發(fā)明中的可明顯改變花生葉片中α生育酚含量(圖4)。
      [0015]?,,APG-m AdC因均受鹽脅迫誘導表達,J/^-2基因受鹽脅迫誘導48 h時可達到對照的27.7倍基因受鹽脅迫誘導6 h時可達到對照的9倍(圖3)。
      [0016]4、將花生J/^-7和AdC因在花生中超量表達,花生轉(zhuǎn)基因種子在0.7% NaCl溶液中發(fā)芽率分別可達到36%和49%,而非轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽率只有15% ;本發(fā)明將APG-1和基因在花生過量表達可顯著提高種子(圖5)和植株(圖6)的耐鹽性。
      [0017]本發(fā)明以花生這一重要的油料作物為實驗材料,克隆了 2個維生素E生物合成途徑中的重要基因APG-1和么并對其功能驗證。這將為以后通過基因工程調(diào)控花生的α生育酚含量和提高植株的抗逆能力奠定基礎(chǔ)。
      [0018]結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實施方式】后,本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點將變得更加清
      /H- ο
      【附圖說明】
      [0019]圖1是本發(fā)明中花生的遺傳轉(zhuǎn)化,Α:在SM培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d的子葉外植體;B:在SM+cef培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 w的子葉外植體;C:添加100 mg /L卡那霉素的SEM+cef培養(yǎng)基上篩選的抗性芽(培養(yǎng)4 w); D: 150 mg /L卡那霉素的SEM+cef培養(yǎng)基上篩選的抗性苗(培養(yǎng)6 W)。
      [0020]圖2是本發(fā)明中擬轉(zhuǎn)J/^-7和AdC因植株的PCR鑒定,左側(cè)為擬轉(zhuǎn)J/^-7基因陽性苗鑒定DL2000; 1:未轉(zhuǎn)基因植株(對照);2-8:擬轉(zhuǎn)基因植株;右側(cè)為擬轉(zhuǎn)
      基因陽性苗鑒定:M: DL2000; 1:未轉(zhuǎn)基因植株(對照);2-8:擬轉(zhuǎn)基因植株圖3是本發(fā)明中1.5% NaCl脅迫處理后APG-1和AdC因在不同時間段的相對表達量。
      [0021 ] 圖4是本發(fā)明中對照花育23號和T2代轉(zhuǎn)基因花生種子在0.7%的NaCl溶液中的發(fā)芽情況;a:花育23號種子;b:過量表達J/^-2基因的T2代花生種子;c:過量表達基因的T2代花生種子。
      [0022]圖5是本發(fā)明中對照花育23號和T2R轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)1.5%的NaCl溶液脅迫處理7天后的情況;左:花育23號種子;中:過量表達J/^-2基因的T2代花生植株;右:過量表達AdC因的τ 2代花生植株。
      [0023]圖6是本發(fā)明中用高效液相色譜測定對照花育23號和1~2代轉(zhuǎn)基因植株葉片的生育酚含量,圖6a:花育23號葉片的生育酚含量;圖6b:過量表達J/^-2基因的T2代花生葉片的生育酚含量;圖6c:過量表達基因的T2代花生葉片的生育酚含量;圖6d:轉(zhuǎn)化反義基因的1~2代花生葉片的生育酚含量果;圖6e:轉(zhuǎn)化反義基因的1~2代花生葉片的生育酚含量。
      [0024]圖7是本發(fā)明中過量表達APGl基因T2代種子的品種性狀。
      [0025]圖8是本發(fā)明中過量表達基因T 2代種子的品種性狀。
      【具體實施方式】
      [0026]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明技術(shù)方案作進一步詳細的說明。
      [0027]實施例1:花生維生素E合成相關(guān)基因APG1、APG2 一、實驗材料
      1.基因、菌種與花生品種
      本發(fā)明克隆了花生2個基因(AAAU和,大腸桿菌DH5 α由青島農(nóng)業(yè)大學遺傳研宄室實驗室保存,根癌農(nóng)桿菌菌株ΕΗΑ105 (購自北京天恩澤基因科技有限公司),轉(zhuǎn)基因的受體材料為花生品種“花育23號”(由山東農(nóng)科院花生所育成,青島農(nóng)業(yè)大學遺傳研宄室實驗室引進)。
      [0028]2.植物培養(yǎng)基花生轉(zhuǎn)化中采用的培養(yǎng)基有:
      基本培養(yǎng)基:為MS無機鹽+85有機成分(簡稱MSB5),添加3%蔗糖、0.8%瓊脂,ρΗ=5.8,在121。。、105 Kpa條件下滅菌20min ;
      SM 誘導培養(yǎng)基:MSB5+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2,4_D ;
      SEM芽伸長培養(yǎng)基:MSB5+5 mg/L BAP。
      [0029]cef:頭孢霉素。
      [0030]二、實驗方法
      本發(fā)明包括以下具體實驗步驟:
      1、擴增獲得基因全序列
      花生J/^-7基因,其序列表如SEQ ID No:1所示,其氨基酸序列表如SEQ ID No: 2所示。
      [0031]花生基因,其序列表如SEQ ID No:3所示,其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。
      [0032]克隆所述花生J/^-7和基因的引物名稱與序列如下:Pl:5 ; - TCAGGTTCCTTCTTCAACAATGGCT -3 ; (SEQ ID No:7);
      P2:5 ; - ACGGCTCTTAGATTGGCTGACCCT -3 ; (SEQ ID No:8);
      分別與基因第1-25堿基、第2406-2429堿基對應(yīng);與AdC因第1_25堿基、第2406-2429堿基對應(yīng)。
      [0033]2、基因植物表達載體的構(gòu)建
      (I)擴增義^基因編碼區(qū)
      花生品種“花育23號”由青島農(nóng)業(yè)大學遺傳研宄室實驗室引進,通過RT-PCR擴增了基因的編碼區(qū)(APG1編碼區(qū)序列表如SEQ ID No:5所示,APG2編碼區(qū)序列表如SEQ IDNo:6所示)。
      [0034]P3:5 ' - GGTACCTCAGGTTCCTTCTTCAACAATGGCT ~3 ' {Kpnl) (SEQ ID No:9);
      Ρ4:5 ' - GGTACCACGGCTCTTAGATTGGCTGACCCT -3 ' {Kpnl) (SEQ ID No:10);
      上述引物序列除去酶切接頭外分別與基因的第1-25堿基、第1059-1082堿基對應(yīng);與基因的第1-25堿基、第1059-1082堿基對應(yīng)。
      [0035](2) 基因與克隆載體pUC18及植物表達載體pBI121的連接
      回收PCR產(chǎn)物,并在T4 DNA連接酶作用下與克隆載體pUC18 (購買于TaKaRa)進行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a獲得了抗氨芐青霉素的菌落。提取重組質(zhì)粒,測序后獲得2種不同的DNA片段,分別命名為和AhAPG-2a用Kpnl進行酶切,回收含AhAPGim基因的酶切片段,分別正向克隆到植物表達載體pBI121的對應(yīng)酶切位點中,獲得該基因的植物表達載體pBI和PBI121- AMPG2'反向克隆到植物表達載體pBI121的對應(yīng)酶切位點中,獲得該基因的反義表達載體:反義和反義^H2l-AhAPG20
      [0036]3、將上述表達載體轉(zhuǎn)化花生,包括以下步驟:
      a、農(nóng)桿菌重組菌株的制備、活化及菌液制備:分別將
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