從白刺種子中分離純化一種手性生物堿rsMTCA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及從白刺種子中分離純化一種手性生物堿的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白刺種子中含有多種活性成分，目前從白刺種子中分離得到了很多活性物質(zhì)，主 要有以下幾類物質(zhì)，黃酮類：槲皮素、異鼠李素-7-Ο-α-L-鼠李糖甙、山奈素-7-Ο-α-L-鼠 李糖甙、異鼠李素-7-Ο-β-D-葡萄糖甙、槲皮素-7-0-a-L-鼠李糖甙、異鼠李糖、尿囊 素、胡蘿卜苷、異鼠李糖；生物堿類：L-色氨酸、尿囊素和1-甲基-1，2,3,4-四氫-β -咔 啉-3-羧基酸（l-Methyl-l，2, 3,4_tetrahydr〇- β -carboline-3-carboxylic acid，簡稱 MTCA)〇
[0003] MTCA屬于吲哚類生物堿，目前吲哚類生物堿的研宄已成為抗腫瘤活性藥物的熱 點，特別是在新藥及其新藥先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)中起著不可替代的作用。吲哚類生物堿抗腫瘤 成分主要對卵巢癌、淋巴癌和消化道系統(tǒng)癌如肝癌、結(jié)腸癌等有較顯著的療效。此外，吲哚 類生物堿抗腫瘤成分在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及提高機(jī)體免疫方面亦表 現(xiàn)出一定的作用。MTCA活性實驗表明MTCA具有較強(qiáng)的清除羥基自由基的能力，在細(xì)胞濃度 低于30 μ g/mL時對人表皮細(xì)胞Hucat有一定的促進(jìn)作用，同時對人肝癌細(xì)胞7221細(xì)胞有 促進(jìn)凋亡的作用。
[0004] 研宄表明MTCA廣泛的存在于食品中如小麥、黑麥面粉、大豆蛋白、牛乳以及酒精 飲料如啤酒和紅酒中。從食品、酒精飲料以及生物樣品分離出來的MTCA通常會包括兩種類 型（1S，3S)-1-甲基-1，2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧基酸（簡稱 ssMTCA)和（1R，3S)-1-甲 基-1，2, 3,4-四氫-β-咔啉-3-羧基酸（簡稱rsMTCA)。在兩個MTCA的非對映體中，ssMTCA 的含量是rsMTCA含量的四倍之多。對兩種異構(gòu)體的分離純化研宄，可以為更好地認(rèn)識各異 構(gòu)體生理藥理活性打下基礎(chǔ)。
[0005] 之前對其中的單一化合物即SSMTCA的分離主要是通過硅膠柱結(jié)合葡聚糖凝膠 LH-20和RP-18柱純化得到或者是通過液液提取結(jié)合固相微萃取與離子交換獲得。還未見 從白刺種子中分離純化rsMTCA的研宄報道。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 高速逆流色譜（High-speed counter-current chromatography，簡稱HSCCC)分離 技術(shù)是一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)，它不用任何固態(tài)的支撐物或載體，利用 兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學(xué)平衡，其中一相 作為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量的固定相，物質(zhì)的分離依 據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)，特別適合于天然產(chǎn)物活性成分的分離。本發(fā)明的目 的就在于提供一種利用HSCCC技術(shù)從白刺種子中提取分離rsMTCA的方法。
[0008] 具體地，本發(fā)明提供了從白刺種子中分離純化（1R，3S)-1-甲基-1，2,3,4-四 氫-β -咔啉-3-羧基酸的方法，它包括如下操作步驟：
[0009] (1)粗提物的制備：
[0010] 取白刺種子，以乙醇為溶劑進(jìn)行提取，提取液回收乙醇至無醇味，加入石油醚進(jìn)行 萃取，取水層，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、10% V/V乙醇溶液洗脫，收集10% V/V乙醇洗 脫液，濃縮、干燥即得粗提物；
[0011] (2)采用高速逆流色譜法分離：
[0012] 取正丁醇：0.5%甲酸=5 : 6V/V，置于分液漏斗中配制兩相溶劑系統(tǒng)，取上相為 固定相，下相為流動相；取粗提物，溶解于適量固定相和流動相的混合液中，得到樣品溶液； 以20~40mL/min的流速將固定相泵入主機(jī)并充滿分離螺線管，保持溫度25~30°C，主 機(jī)正向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為800~1000r/min，以1. 5~3mL/min的速度泵入流動相，待流動相從 管柱口流出且基線穩(wěn)定后，注入樣品溶液，在254~280nm波長下進(jìn)行檢測，收集出峰時間 300~350min的成分，即得初步純化物；
[0013] (3)半制備液相色譜分離：
[0014] 取初步純化物，上半制備液相色譜，在254~280nm下檢測，收集第二大色譜峰洗 脫部位，除去溶劑即可得到（1R，3S) -1-甲基-1，2,3,4-四氫-β -咔啉-3-羧基酸，色譜條 件如下：
[0015] 流動相：甲醇-水=(25~30) : (75~70)。
[0016] 進(jìn)一步地，步驟⑴中，提取所用乙醇的濃度為65%~95%，進(jìn)一步為70%~ 80%，優(yōu)選為75%￥八。
[0017] 進(jìn)一步地，所述大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂，優(yōu)選使用DlOl樹脂。
[0018] 進(jìn)一步地，步驟（2)中，固定相的流速為30mL/min，溫度為30°C，主機(jī)轉(zhuǎn)速為900r/ min，流動相的流速為I. 7mL/min。
[0019] 本發(fā)明實驗中對影響分離效果的其它主要因素如主機(jī)轉(zhuǎn)速、流動相流速、以及水 浴溫度進(jìn)行了選擇與優(yōu)化。結(jié)果表明，低的進(jìn)樣量、高主機(jī)轉(zhuǎn)速和低流動相流速可以改善分 離的效果，提高固定相的保留率，但相應(yīng)的會增加分離所需要的時間。水浴溫度的增高可以 降低分離所需要的時間，因此最終確定的分離條件為：流動相流速為I. 7mL/min，主機(jī)轉(zhuǎn)速 為 900rpm/min，溫度為 30°C。
[0020] 進(jìn)一步地，步驟（2)、（3)中，檢測波長為254nm。
[0021] 本發(fā)明半制備色譜中，甲醇濃度高會導(dǎo)致分離速度快，保留時間短，但分離效果不 理想。甲醇濃度低可以改善樣品的分離效果，但分離速度相應(yīng)縮短，分離時間延長。因此綜 合考慮，本實驗采用30%甲醇等度洗脫，即流動相為甲醇-水=30 : 70。
[0022] 本發(fā)明利用高速逆流色譜并采用了合理的溶劑體系從白刺中獲得高純度的（1R， 3S)-1-甲基-1，2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧基酸，該技術(shù)不需要使用固相載體，無不可 逆吸附，樣品無損失、無污染、高效、快速、低成本分離制備（1R，3S)-1-甲基-1，2,3,4-四 氫-β -咔啉-3-羧基酸。本發(fā)明工藝簡單、操作方便、安全、重復(fù)性好，可工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0023] 圖1本發(fā)明逆流色譜圖
[0024] 圖2本發(fā)明化合物的半制備色譜圖
[0025] 圖 3 ssMTCA 的 HPLC 圖譜
[0026] 圖4初步純化物的HPLC圖譜
[0027] 圖5本發(fā)明目標(biāo)化合物rsMTCA的色譜圖
[0028] 本發(fā)明圖譜中，標(biāo)注為數(shù)字"2"的色譜峰為ssMTCA，標(biāo)注為數(shù)字"3"的色譜峰為 rsMTCA〇
【具體實施方式】
[0029] 實施例1 :
[0030] 1、粗提物制備
[0031] 白刺種子經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)粉碎后，中藥煎煮機(jī)中以I : 10kg/L的料液比進(jìn)行提 取，提取時間2h，提取溶劑75%的乙醇，提取次數(shù)為3次。3次提取后將提取溶液合并，回收 乙醇至無醇味，加入石油醚進(jìn)行反復(fù)萃取。將經(jīng)過石油醚萃取后的水層于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃 縮蒸干，加水溶解，上DlOl大孔樹脂進(jìn)行初步分離。對大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫，洗脫溶液及濃 度依次是：水、10 % V/V乙醇溶液，收集10 %乙醇洗脫液部分，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮蒸干備 用。
[0032] 2、采用高速逆流色譜法分離：
[0033] 取正丁醇：0.5%甲酸=5 : 6V/V，置于分液漏斗中配制兩相溶劑系統(tǒng)，取上相為 固定相，下相為流動相；取粗提物，溶解于適量固定相和流動相的混合液中，得到樣品溶液； 以30mL/min的流速將固定相泵入主機(jī)并充滿分離螺線管，保持溫度30°C，主機(jī)正向旋轉(zhuǎn)， 轉(zhuǎn)速為900r/min，以I. 7mL/min的速度泵入流動相，待流動相從管柱口流出且基線穩(wěn)定后， 注入樣品溶液，在254nm波長下進(jìn)行檢測，收集出峰時間300~350min的成分，即得初步純 化物（逆流色譜圖見圖1);
[0034] 3、半制備液相色譜分離：
[0035] 取初步純化物，上半制備液相色譜，在254nm下檢測，收集目標(biāo)化合物洗脫部位 (制備色譜圖見圖2,第二大峰即為rsMTCA)，除去溶劑即可得到（1R，3S)-1-甲基_1，2,3， 4-四氫-β-咔啉-3-羧基酸，色譜條件如下：流動相：甲醇-水=30 : 70。
[0036] 實施例2 :
[0037] 1、粗提物制備
[0038] 白刺種子經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)粉碎后，中藥煎煮機(jī)中以I : 15kg/L的料液比進(jìn)行提 取，提取時間3h，提取溶劑65%的乙醇，提取次數(shù)為3次。3次提取后將提取溶液合并，回收 乙醇至無醇味，加入石油醚進(jìn)行反復(fù)萃取。將經(jīng)過石油醚萃取后的水層于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃 縮蒸干，加水溶解，上DlOl大孔樹脂進(jìn)行初步分離。對大孔樹脂進(jìn)行洗脫，洗脫溶液及濃度 依次是：水、10% V/V乙醇溶液，收集10%乙醇洗脫液部分，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮蒸干備用。
[0039] 2、采用高速逆流色譜法分離：
[0040] 取正丁醇：0.5%甲酸=5 : 6V/V，置于分液漏斗中配制兩相溶劑系統(tǒng)，取上相為 固定相，下相為流動相；取粗提物，溶解于適量固定相和流動相的混合液中，得到樣品溶液； 以20mL/min的流速將固定相泵入主機(jī)并充滿分離螺線管，保持溫度30°C，主機(jī)正向旋轉(zhuǎn)， 轉(zhuǎn)速為800r/min，以I. 5mL/min的速度泵入流動相，待流動相從管柱口流出且基線穩(wěn)定后， 注入樣品溶液，在280nm波長下進(jìn)行檢測，收集出峰時間300~350min的成分，即得初步純 化物（逆流色譜圖見圖1);
[0041] 3、半制備液相