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      白刺種子或其提取物中ss或/和rsMTCA的檢測方法

      文檔序號:9303558閱讀:927來源:國知局
      白刺種子或其提取物中ss或/和rsMTCA的檢測方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及從白刺種子或其提取物中同時(shí)檢測兩種手性生物堿的方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 白刺種子中含有多種活性成分,目前從白刺種子中分離得到了很多活性物質(zhì),主 要有以下幾類物質(zhì),黃酮類:槲皮素、異鼠李素-7-0-a-L-鼠李糖甙、山奈素-7-0-a-L-鼠 李糖甙、異鼠李素-7-0-0-D-葡萄糖甙、槲皮素-7-0-a-L-鼠李糖甙、異鼠李糖、尿囊 素、胡蘿卜苷、異鼠李糖;生物堿類:L-色氨酸、尿囊素和1-甲基_1,2,3,4_四氫-0-咔 啉-3-駿基酸(1-Methyl-l,2, 3,4_tetrahydr〇- 0 -carboline-3-carboxylicacid,簡稱 MTCA)〇
      [0003] MTCA屬于吲哚類生物堿,目前吲哚類生物堿的研究已成為抗腫瘤藥物活性的熱 點(diǎn)。特別是在新藥及其新藥先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)中起著不可替代的作用。吲哚類生物堿抗腫瘤 成分主要對卵巢癌、淋巴癌和消化道系統(tǒng)癌如肝癌、結(jié)腸癌等有較顯著的療效。此外,吲哚 類生物堿抗腫瘤成分在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及提高機(jī)體免疫方面亦表 現(xiàn)出一定的作用。MTCA活性實(shí)驗(yàn)表明MTCA具有較強(qiáng)的清除羥基自由基的能力,在細(xì)胞濃度 低于30yg/mL時(shí)對人表皮細(xì)胞Hucat時(shí)有一定的促進(jìn)作用,同時(shí)對人肝癌細(xì)胞7221細(xì)胞 有促進(jìn)凋亡的作用。
      [0004] 研究表明MTCA廣泛的存在于食品中如小麥、黑麥面粉、大豆蛋白、牛乳以及酒精 飲料如啤酒和紅酒中。從食品、酒精飲料以及生物樣品分離出來的MTCA通常會包括兩種類 型(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-0-咔啉-3-羧基酸(簡稱ssMTCA)和(1R,3S)-1-甲 基-1,2,3,4-四氫-0-咔啉-3-羧基酸(簡稱rsMTCA)。在兩個(gè)MTCA的非對映體中,ssMTCA 的含量是rsMTCA含量的四倍之多。對兩種異構(gòu)體的提取分離研究,可以為更好地認(rèn)識各異 構(gòu)體生理活性打下基礎(chǔ)。
      [0005]
      [0006] 目前,還未見對白刺種子或其提取物中的ss、rsMTCA進(jìn)行HPLC檢測報(bào)道。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007] 本發(fā)明的目的就在于提供一種對白刺種子或其提取物中ssMTCA或/和rsMTCA進(jìn) 行檢測的方法。
      [0008] 具體地,本發(fā)明提供了白刺種子中(1S,3S)或/和(1R,3S)構(gòu)型的1-甲基_1,2, 3,4_四氫-咔啉-3-羧基酸的檢測方法,它是采用HPLC技術(shù)進(jìn)行測定的,具體操作如 下:
      [0009] (1)供試品溶液的制備:
      [0010] 取白刺種子,以乙醇水溶液為溶劑進(jìn)行提取,提取液回收乙醇至無醇味,加入石油 醚進(jìn)行萃取,取水層,上大孔吸附樹脂柱,依次用水、10%V/V乙醇溶洗脫,收集10%V/V乙 醇洗脫液,濃縮、干燥即得粗提物,取粗提取物制備供試品溶液即可;
      [0011] (2)將供試品溶液注入高效液相色譜儀中,對(1S,3S)或/和(1R,3S)構(gòu)型的1-甲 基-1,2, 3,4-四氫-0 -咔啉-3-羧基酸進(jìn)行測定即可,其中,色譜條件如下:
      [0012] 色譜柱:十八烷基鍵合硅膠柱;
      [0013] 流動相A:甲醇;流動相B:水;梯度洗脫條件:0-16min,10 % -27 %V/VA; 16-21min,27% -29%V/VA;21-35min,29% -45%V/VA;檢測波長:254 ~280nm,優(yōu)選為 254nm〇
      [0014] 本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】中,使用的色譜柱型號為AgilentEclipse)(DB-C18。
      [0015] 其中,步驟⑴中,提取所用乙醇的濃度為65%~95%,進(jìn)一步為70%~80%,優(yōu) 選為 75%V/V。
      [0016] 進(jìn)一步地,所述大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂。
      [0017] 更進(jìn)一步地,所述大孔吸附樹脂為D101樹脂。
      [0018] 其中,供試品溶液的溶劑為水。
      [0019] 其中,步驟(2)中,流動相流速為0? 5~lmL/min,優(yōu)選為lmL/min;柱溫為25~ 30°C,優(yōu)選為 30°C。
      [0020] 其中,步驟(2)中,采用面積歸一法或者外標(biāo)法對(1S,3S)或/和(1R,3S)構(gòu)型的 1-甲基-1,2, 3,4-四氫-0 -咔啉-3-羧基酸進(jìn)行測定。
      [0021] 本發(fā)明還提供了白刺種子提取物中(1S,3S)或/和(1R,3S)構(gòu)型的1-甲基_1,2, 3,4_四氫-咔啉-3-羧基酸的檢測方法,它是采用HPLC技術(shù)進(jìn)行測定的,具體操作如 下:
      [0022] (1)供試品溶液的制備:
      [0023] 取白刺種子提取物,溶解后制備成供試品溶液;其中,白刺種子提取物由如下方法 制備得到:
      [0024] 取白刺種子,以乙醇水溶液為溶劑進(jìn)行提取,提取液回收乙醇至無醇味,加入石油 醚進(jìn)行萃取,取水層,上大孔吸附樹脂柱,依次用水、10%V/V乙醇溶洗脫,收集10%V/V乙 醇洗脫液,濃縮、干燥即得粗提物;取正丁醇:0.5%甲酸=5 : 6V/V,置于分液漏斗中配制 兩相溶劑系統(tǒng),取上相為固定相,下相為流動相;取粗提物,溶解于適量固定相和流動相的 混合液中,得到樣品溶液;以20~40mL/min的流速將固定相栗入主機(jī)并充滿分離螺線管, 保持溫度25~30°C,主機(jī)正向旋轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)速為800~1000r/min,以1. 5~3.OmL/min的速度 栗入流動相,待流動相從管柱口流出且基線穩(wěn)定后,注入樣品溶液,在254~280nm波長下 進(jìn)行檢測,收集出峰時(shí)間300~350min的成分,即得白刺種子提取物;
      [0025] (2)將供試品溶液注入高效液相色譜儀中,對(1S,3S)或/和(1R,3S)構(gòu)型的1-甲 基-1,2, 3,4-四氫-0 -咔啉-3-羧基酸進(jìn)行測定即可,其中,色譜條件如下:
      [0026] 流動相A:甲醇;流動相B:水;梯度洗脫條件:0-16min,10 % -27 %V/VA; 16-21min,27% -29%V/VA;21-35min,29% -45%V/VA;檢測波長:254nm。
      [0027] 進(jìn)一步地,步驟(1)中,固定相的流速為30mL/min,溫度為30°C,主機(jī)轉(zhuǎn)速為900r/ min,流動相的流速為1. 7mL/min。
      [0028] 進(jìn)一步地,步驟(2)、(3)中,檢測波長為254nm。
      [0029] 本發(fā)明的有益效果:
      [0030] (1)本發(fā)明首次在唐古特白刺種子中發(fā)現(xiàn)了rsMTCA,基于MTCA在食物、醫(yī)藥領(lǐng)域 的實(shí)用性,對白刺種子或其提取物中的ssMTCA和rsMTCA的檢測也顯得十分必要。本發(fā)明 利用特定的流動相洗脫條件,首次實(shí)現(xiàn)了分別或同時(shí)對白刺種子或其提取物中的ssMTCA、 rsMTCA的檢測,為白刺種子或其提取物的開發(fā)利用提供了保障。
      [0031] (2)ssMTCA和rsMTCA互為光學(xué)異構(gòu)體,兩者僅只有在1位的甲基取代構(gòu)象不同,兩 者的化學(xué)性質(zhì)極為相近。毋庸置疑,兩者的極性也十分接近,高效液相色譜是利用不同化合 物在流動相和固定相之間的極性選擇差異來對不同化合物進(jìn)行分離從而實(shí)現(xiàn)檢測的,若是 希望使用液相色譜技術(shù)將兩個(gè)極性極為相似的化合物進(jìn)行分離,是極其困難的。梯度洗脫 是面對復(fù)雜分離過程的首選洗脫方式,然而,梯度洗脫過程中,流動相種類、梯度程序(即 時(shí)間和相對應(yīng)的流動相配比)的選擇是無限的,如何選擇一種適合于ssMTCA和rsMTCA的 梯度洗脫條件,是需要發(fā)明人付出大量的實(shí)踐和總結(jié)、分析才能得到的。本發(fā)明最終發(fā)現(xiàn) 的流動相梯度洗脫條件,能夠有效將白刺種子中的多種化學(xué)成分分離,更重要的是,能夠?qū)?ssMTCA和rsMTCA分開,為兩者化合物的分別測定提供了基礎(chǔ)。
      【附圖說明】
      [0032] 圖1白刺種子中ssMTCA和rsMTCA的HPLC檢測圖譜
      [0033] 圖2白刺種子提取物制備過程中的逆流色譜圖
      [0034] 圖3白刺種子提取物中ssMTCA和rsMTCA的HPLC檢測圖譜
      [0035] 圖4ssMTCA對照品的HPLC圖譜
      [0036] 圖5rsMTCA對照品的HPLC圖譜
      [0037] 圖6半制備色譜圖
      [0038] 圖7流動相梯度為0-16-21-35min(10%-29%-29%-45%甲醇)時(shí)的色譜圖,其 檢測的供試品溶液同實(shí)施例1
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