一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于四氧化=鐵納米顆粒的制備領(lǐng)域，特別設及一種乳糖酸修飾的超小型 超順磁四氧化=鐵納米顆粒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是我國常見的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率較高，高發(fā)的年齡在40~50歲之間， 是所有惡性腫瘤中的第二號殺手，嚴重影響廣大人民群眾的身體健康。一直W來，由于肝癌 治療效果較差，甚至曾被稱為"癌中之王"。通過造影劑來增強造影，提高早期精確診斷水 平，W便手術(shù)切除或者放化療去除病灶，可W大大提高患者生存率。在醫(yī)用肝臟增強造影 中，常用的造影劑包括Tl加權(quán)MR成像的含禮造影劑（Gd-DTPA和Gd-DOTA等）和T2加權(quán)MR 成像的超順磁性氧化鐵顆粒。然而，前者有潛在的腎毒性和血液循環(huán)時間短等缺點；后者存 在容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨隧細胞清除等不足。因此，研發(fā)生物相容性好且具有高效肝臟 造影功能的新型造影劑迫在眉睫。
[0003] 近年來，超順磁性四氧化=鐵納米顆粒在生物醫(yī)學領(lǐng)域有著越來越廣泛的應用， 特別是用作核磁共振（MR)成像的造影劑。本課題組已通過簡易的溫和還原法制備了兩種 不同癌細胞受體祀向能力的四氧化=鐵納米顆粒，并探索了其在MR成像診斷中應用的可 行性（沈明武，李靜超，胡勇，孫文杰，史向陽。一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的 制備方法。中國發(fā)明專利，專利【申請?zhí)枴?014101828211,申請日期：2014-04-03 ;J.Mater. 化em.B，2015, 3, 5720-5730。沈明武，胡勇，李靜超，韋平，史向陽。一種RGD修飾的超小型 超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法。中國發(fā)明專利，專利【申請?zhí)枴?014106044681,申請日 期：2014-10-30;Huetal. ,Biomater.Sci.，2015, 3, 721-732)。運些制備的四氧化S鐵納 米顆粒的弛豫率在400mMIs1W上，可有效減少造影劑的劑量并達到靈敏檢測的目的。
[0004] 乳糖酸本身即存在于人體中，有強力的抗氧化作用，使其早已應用在器官移植中 W防止器官受到自由基的傷害，增加了器官的保存性。此外，乳糖酸作為一種半乳糖，也是 一種引人注目的腫瘤祀向分子，能夠通過與肝癌細胞表面特異性表達的去唾液酸糖蛋白受 體（ASGPRs)結(jié)合。但是，乳糖酸修飾在四氧化=鐵納米顆粒表面的研究卻鮮為報道。此 夕F，納米顆粒的PEG化修飾可延長其在血液中的循環(huán)時間，逃離網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞隧，更有 助于實現(xiàn)乳糖酸對ASGPRs高表達的腫瘤細胞的祀向。因此，制備具有更高弛豫率的四氧化 =鐵納米顆粒實現(xiàn)對肝癌的祀向MR成像就顯得尤為有意義。檢索國內(nèi)外文獻，尚沒有發(fā)現(xiàn) 關(guān)于用溫和還原法制備具有超高弛豫率的乳糖酸特異祀向能力的化3〇4納米探針用于體外 和體內(nèi)原位肝癌腫瘤模型的祀向MR成像診斷研究的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化=鐵 納米顆粒的制備方法，該方法操作簡單，反應條件溫和，易于操作，成本較低；制備的化304 納米顆粒能夠長時間穩(wěn)定地分散于水溶液中，不會出現(xiàn)團聚現(xiàn)象；所用的修飾劑PEI為廉 價和環(huán)境友好材料，具有產(chǎn)業(yè)化實施的前景。
[0006] 本發(fā)明的一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化S鐵納米顆粒的制備方法，包 括：
[0007] (1)將=價鐵鹽溶于超純水中，氮氣鼓吹，加入亞硫酸鋼溶液，反應30~40分鐘， 依次加入超支化聚乙締亞胺PEI水溶液和NHs?&0,60~70°C下恒溫攬拌反應30~40分 鐘；然后在室溫下反應1. 5~3小時，將產(chǎn)物磁分離，洗涂，得到PEI包裹的超小型超順磁四 氧化S鐵納米顆?；?〇4/陽I.NHz;其中，S價鐵鹽、亞硫酸鋼和PEI的質(zhì)量比為1. 2~1. 4 : 0. 20~0. 25 :0. 50~0. 53 價鐵鹽、超純水和畑3?&0的配比為1. 2~1. 4g:20~25血： 2~SmL; 陽00引 似將步驟（1)中的化化/PEI.畑2洗涂，分散于溶劑中，然后加入FI溶液，攬拌， 磁分離，洗涂，分散于水中，得到fWVPEI.NHz-FI納米顆粒水溶液；其中，F(xiàn)e3〇4/PEI.畑2中 的PEI和FI的摩爾比是1 :10~15 ; W09] 做將LA與邸S和N服混合溶于憐酸鹽緩沖溶液PBS中，攬拌活化，加入到COOH-PEG-NHz的PBS溶液中，攬拌2~4天，透析，真空冷凍干燥，得到COOH-陽G-LA;其中， LA與COOH-陽G-NHz的摩爾比是1~1. 5 :1 ;
[0010] (4)將步驟做中的COOH-陽G-LA與邸C和N服混合溶于水中，攬拌活化，然后加 入到步驟（2)中的得到化3O4/PEI.N&-FI納米顆粒水溶液中，攬拌2~4天，磁分離，洗涂， 分散于水中，得到化3〇4/陽I.NHz-FI-PEG-LA納米顆粒水溶液；其中，COOH-陽G-LA和化3O4/ 陽I.NHz-FI中陽I的摩爾比是15~20:1; 1] 妨將S乙胺加入到步驟（4)中化化/PEI.NHz-FI-PEG-LA納米顆粒水溶液中， 攬拌20~40分鐘，然后加入乙酸酢，攬拌20~30小時，磁分離，洗涂，得到Fe3〇4/陽I.NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒；其中，S乙胺、乙酸酢和化3O4/PEI.NHz-FI-PEG-LA上陽I伯胺的 摩爾比是5~10 :5~10 :1。
[0012] 所述步驟（1)中S價鐵鹽為FeCls?6&0。
[0013] 所述步驟（1)中的超支聚乙化締亞胺PEI的分子量為25000。
[0014] 所述步驟（1)中的畑3?&0質(zhì)量百分比濃度為25~28%。 陽01引所述步驟似中溶劑為DMS0,FI溶液的溶劑為DMS0。
[0016] 所述步驟似中攬拌的時間為1~2天。
[0017] 所述步驟（3)中LA、EDS和N服的摩爾比為1~1. 5 :1~1. 5 :1~1. 5。 陽0化]所述步驟（3)中PBS溶液的抑值為6. 0。
[0019] 所述步驟（3)中COOH-PEG-NHz的分子量為2000。
[0020] 所述步驟（3)中透析為用截留分子量1000的透析袋透析2~4天。
[0021] 所述步驟（4)中C00H-PEG-LA、EDC和NHS的摩爾比是1 :8~10 :8~10。 陽02引所述步驟（3)和步驟（4)中攬拌活化的時間為2~地。
[002引所述步驟妨中洗涂的次數(shù)為3~5次。
[0024] 本發(fā)明合成了一種基于乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化=鐵納米顆粒。為 了克服裸露化3〇4普遍存在的磁學特性導致的聚集現(xiàn)象，并提高其在生物醫(yī)學成像領(lǐng)域 的可應用性，在反應過程中加入聚乙締亞胺陽I用于介導化3〇4的合成，從而實現(xiàn)簡易 "一步"還原法制備了膠體穩(wěn)定性良好的PEI包覆的化化/PEI.畑2。為了使制備的該種 化3O4/PEI.NHz能有效地應用到生物體內(nèi)，在其表面接上異硫氯酸巧光素（FI)用于納米 顆粒的示蹤；為實現(xiàn)特定腫瘤部位的成像檢測，在其表面修飾聚乙二醇-乳糖酸復合物 (Polyeth}deneglyco^LA，COOH-PEG-LA);最后通過乙酷化中和PEI表面剩余的氨基， 降低納米顆粒的表面電勢，從而進一步提高其生物相容性。此外，實驗數(shù)據(jù)表明，制備的 Fe3〇4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒有很顯著的Tz加權(quán)成像效果，其r2弛豫率分別高達 579. 89mMIs1。最后WASGPRs高表達的胎pG2細胞（一種肝癌細胞）為模型細胞和肝癌 原位腫瘤模型對制備的乳糖酸祀向的多功能納米探針的性質(zhì)進行一一評價。本發(fā)明制備的 化3〇4納米探針在生物醫(yī)學方面表現(xiàn)出良好特性，特別是超高的r2弛豫率，有望實現(xiàn)在不同 疾病系統(tǒng)的準確和靈敏診斷，為化3〇4納米探針用作臨床造影劑提供可靠的依據(jù)。
[0025] 本發(fā)明操作簡便易行，原材料成本低。制備的納米顆粒具有良好的分散性、膠體穩(wěn) 定性和生物相容性。與ASGPRs低表達的