一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料及其應(yīng)用
【專利說明】一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料及其應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于材料制備領(lǐng)域，更具體地，涉及一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]三維多孔納米支架能夠模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞生長提供支持，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、組織工程學(xué)等研究領(lǐng)域。幾乎所有的組織細(xì)胞在體內(nèi)都是在三維條件下生長，細(xì)胞被包裹在由膠原纖維作為主要成分組成的納米纖維水凝膠之中，此外，細(xì)胞外基質(zhì)中還含有大量的不溶性基質(zhì)蛋白和可溶性生長因子。但目前研究中細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中所采用的大多都是二維培養(yǎng)，即細(xì)胞在培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)，這與體內(nèi)生長環(huán)境相差較大，影響細(xì)胞生長，甚至?xí)鸺?xì)胞基因或者功能變化。如何體外構(gòu)建具有模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的人工支架材料，為細(xì)胞提供三維生長環(huán)境一直是生物、醫(yī)學(xué)以及材料工程領(lǐng)域基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品開發(fā)的熱點。
[0004]自組裝短肽RADA16-1是4個重復(fù)的精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸_丙氨酸序列，即(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4，當(dāng)其水溶液調(diào)節(jié)至PH=7時會形成由納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的水凝膠，與天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)很相似，作為組織工程支架、藥物載體和止血材料在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，是自組裝短肽水凝膠材料的典型代表。但是一個顯著的缺點是該材料水溶液具有明顯的酸性(pH=3?4)，不能與細(xì)胞懸液和活性分子直接混合原位成凝膠，即很難實現(xiàn)細(xì)胞包埋在RADA 16-1水凝膠中進(jìn)行三維生長。
[0005]目前關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的報道仍是采用先制備水凝膠然后在其表面種植細(xì)胞的二維培養(yǎng)模式，不能實現(xiàn)真正的三維細(xì)胞培養(yǎng)。而將該材料直接注射體內(nèi)修復(fù)損傷和用于止血時較低的PH會對宿主組織造成損害。自1993年首次報道該材料以來，人們對RADA16-1進(jìn)行了大量的研究，但是對于其酸性的缺點仍不能有效解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明根據(jù)目前自組裝水凝膠材料中的不足，提供了一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供上述多肽材料的制備方法和應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種中性PH下自組裝成水凝膠的多肽材料，包括在RADA16-1序列上分別連接多個酸性氨基酸和多個堿性氨基酸，以此形成兩種帶相反電荷的短肽，混合后自組裝形成所述水凝膠的多肽材料。
[0009]本發(fā)明是以低分子量自組裝短肽為基礎(chǔ)的水凝膠，為細(xì)胞三維生長提供空間，用于構(gòu)建組織工程支架。本材料可在常溫中性pH條件下形成納米纖維水凝膠，模仿了天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，具有良好的理化性能和生物相容性，支持細(xì)胞三維生長，滿足組織工程支架的要求，而且可負(fù)載活性分子藥物，例如生長因子、短肽藥物?？蓮V泛應(yīng)用于軟骨、血管、神經(jīng)、皮膚等人工器官的再生和損傷的修復(fù)。
[0010]優(yōu)選地，所述兩種帶相反電荷的短肽序列分別為
序列1:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-精氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸；
序列2:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-谷氨酸-谷氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸。
[0011]優(yōu)選地，所述兩種帶相反電荷的短肽序列分別為
序列3:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-(賴氨酸)n;
序列4:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-谷氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸；
其中，η為1~10內(nèi)任意一個自然數(shù)。
[0012]申請人發(fā)現(xiàn)，在(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4上接枝賴氨酸，并且與序列4進(jìn)行混合，賴氨酸的接枝數(shù)量可以為1~10中任意一個自然數(shù)，這樣形成的兩對短肽混合后均可以實現(xiàn)中性PH下自組裝的能力。
[0013]優(yōu)選地，將所述兩種帶相反電荷的短肽分別配置成5~15mg/mL的水溶液，按照1:1的體積比混合，調(diào)節(jié)PH至中性，即得所述多肽材料。
[0014]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:在短肽(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4序列上通過化學(xué)共價鍵連接多個酸性氨基酸為主的序列，例如如天冬氨酸和谷氨酸，或者連接多個堿性氨基酸為主的序列，例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸。最終得到在中性PH條件下分別帶有凈正電荷和凈負(fù)電荷的兩條短肽序列，溶于水后調(diào)整其PH至7，兩者混合后形成三維納米多孔水凝膠。該水凝膠保持中性PH值，三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
[0015]本發(fā)明兩對短肽序列的合成是采用了現(xiàn)有的接枝方向獲得，由于目前未有成型的理論支持何種改性(即接枝序列和接枝位置)能夠獲得真正在中性條件下合成的自組裝多肽水凝膠，不同的序列排列方式不同，電荷分布也不同，同時結(jié)構(gòu)內(nèi)部自組裝方式均會影響最終的接枝效果，因此，上述接枝物的具體接枝位點和接枝序列排布，對最終效果影響非常大。
[0016]與現(xiàn)有多肽自組裝水凝膠相比，本發(fā)明在生理條件下(pH為7-7.4)即可形成三維多孔水凝膠，由直徑約20 nm的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可為細(xì)胞三維培養(yǎng)提供支撐作用。將含有功能性氨基酸序列引入，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長、粘附，同時也可負(fù)載活性分子藥物，如生長因子、短肽藥物，獲得控制釋放。也可注射使用，操作簡便，是非常理想的生物材料。
[0017]本發(fā)明所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料，并且使用過程都是中性的，不會對細(xì)胞核宿主組織產(chǎn)生危害，能夠用于真正的三維培養(yǎng)細(xì)胞，方法為將細(xì)胞懸液分別與所述兩種帶相反電荷的短肽進(jìn)行混合，然后將兩者混合，得到包埋細(xì)胞的水凝膠/細(xì)胞復(fù)合體，并加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0018]進(jìn)一步地，所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料在運用于軟骨、血管、神經(jīng)或皮膚的再生和損傷修復(fù)中，具有極大的應(yīng)用前景。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一種可在常溫中性PH條件，即在人體生理條件自組裝形成三維多孔納米纖維水凝膠。利用本發(fā)明技術(shù)制備的材料具有更好的生物相容性，可實現(xiàn)原位負(fù)載細(xì)胞/活性分子以及體內(nèi)原位注射，在細(xì)胞三維培養(yǎng)、組織工程生物支架材料和藥物載體領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景和臨床應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0020]圖1為兩種修飾改性后的短肽(P1、P2)，混合后形成的水凝膠材料(P1+P2)，向水凝膠擴(kuò)散的細(xì)胞培養(yǎng)基未改變顏色，說明形成的水凝膠呈中性PH ;原子力顯微鏡顯示納米纖維形貌，說明所形成的水凝膠是由納米纖維構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)。
[0021]圖2為三種材料的流變性能對比圖，Pl，P2為改性短肽，P1+P2為兩者混合物。G’為儲能模量，G”為損耗模量。Pl和P2混合后G’大大升高，說明形成了穩(wěn)定的水凝膠。
[0022]圖3為神經(jīng)干細(xì)胞球在不同納米纖維水凝膠中三維生長形貌。A為本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠為RADA 16-1納米纖