鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)及重新分離的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)及 重新分離的方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨疫里默氏桿菌是引起鴨疫里默氏桿菌病的病原菌，鴨疫里默氏桿菌病導(dǎo)致幼鴨 急性或慢性敗血性傳染，是嚴(yán)重危害全世界養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要疾病，而大腸桿菌是造成家 禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失最嚴(yán)重的細(xì)菌病的病原體。
[0003] 臨床上鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌?；旌细腥?，兩種菌均能使不同品種、日齡及 性別的鴨感染發(fā)病，發(fā)病以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎為特征性病理變化， 臨床診斷很難將兩者區(qū)分開來，并且感染兩病的鴨群死亡率高，淘汰率高，對養(yǎng)鴨業(yè)造成極 大經(jīng)濟損失。
[0004] 臨床上常發(fā)現(xiàn)兩種菌之間存在耐藥性轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，但是在體外培養(yǎng)過程中，由于大 腸桿菌短時間內(nèi)便以其競爭優(yōu)勢迫使鴨疫里默氏桿菌停止生產(chǎn)，進而阻斷了二者共同生長 的進程，導(dǎo)致無法進行深入研究。這可能是因為在體內(nèi)的細(xì)菌生長環(huán)境有其特殊的機制，導(dǎo) 致二者長期共同生長進而產(chǎn)生耐藥性轉(zhuǎn)移。如何在體外創(chuàng)造一種環(huán)境讓二者能夠生長20 代以上，從而使耐藥性傳遞（或融合性研究）研究成為可能，具有重要的研究意義。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種操作簡單、為探討鴨疫里默氏桿菌 與大腸桿菌在共生條件下的耐藥性轉(zhuǎn)移及相關(guān)機制提供條件的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿 菌混合培養(yǎng)及重新分離的方法。
[0006] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] 鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)及重新分離的方法，包括如下步驟：
[0008] (1)菌種復(fù)蘇：
[0009] 將凍干保存的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌菌種分別接種于對應(yīng)的培養(yǎng)基中，進行 菌種復(fù)蘇，制得復(fù)蘇后的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌；
[0010] (2)篩選對抗生素敏感性差異的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌：
[0011] 對步驟（1)得到的復(fù)蘇后的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌，采用藥物敏感性試驗篩 選出對某種抗生素敏感性差異的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌；
[0012] (3)混合培養(yǎng)：
[0013] 將步驟（2)篩選出的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌接種于培養(yǎng)基中，即可對鴨疫里 默氏桿菌與大腸桿菌進行混合培養(yǎng)9_12h，并制得混合培養(yǎng)菌液；
[0014] (4)測定步驟（2)中所選用抗生素對步驟（2)篩選出的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿 菌的最小抑菌濃度：
[0015] (5)制備抗生素板培養(yǎng)基：
[0016] 選取介于步驟（4)中測定的所選用抗生素對鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌的最小 抑菌濃度之間的抗生素濃度，制備抗生素平板培養(yǎng)基，備用；
[0017] (6)分離混合培養(yǎng)菌液：
[0018] 將步驟（3)制得的混合培養(yǎng)菌液進行稀釋后，采用涂布平板法，在步驟（5)制得的 抗生素平板培養(yǎng)基中對稀釋菌液中的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌進行培養(yǎng)20_24h，即可對 鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌進行分離。
[0019] 所述步驟（1)中菌種復(fù)蘇的具體方法為：
[0020] (1-1)鴨疫里默氏桿菌菌種復(fù)蘇：
[0021] 量取Iml生理鹽水，將適量凍干保存的鴨疫里默氏桿菌菌種溶解混勻于生理鹽水 中，制得鴨疫里默氏桿菌懸液，將制得的鴨疫里默氏桿菌懸液接種于含4%血清的胰蛋白胨 大豆瓊脂培養(yǎng)基中后，置于〇)2培養(yǎng)箱中37°C下培養(yǎng)20-24h，然后從培養(yǎng)基中挑取單個菌 落接種于含4%血清的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150r/min、溫度為37°C的搖 床上振蕩培養(yǎng)20-24h，制得復(fù)蘇后的鴨疫里默氏桿菌；
[0022] 所述鴨疫里默氏桿菌菌株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。
[0023] (1-2)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株菌種復(fù)蘇：
[0024] 量取Iml生理鹽水，將適量凍干保存的大腸桿菌菌種溶解混勻于生理鹽水中，制 得大腸桿菌懸液，將制得的大腸桿菌懸液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150r/min、溫 度為37°C的搖床上振蕩培養(yǎng)16-20h，制得復(fù)蘇后的大腸桿菌；
[0025] 所述大腸桿菌菌種購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0026] 所述步驟（2)藥物敏感性試驗所采用的方法為紙片瓊脂擴散法，試驗所用藥敏紙 片中的抗生素為慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星中的任意一種，對應(yīng)的藥敏紙片 中慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的含量分別為10 μ g、5 μ g、5 μ g、10 μ g ;其中， 判定鴨疫里默氏桿菌對慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星敏感的標(biāo)準(zhǔn)分別為抑菌圈 直徑小于等于12mm、15mm、12mm、12mm，判定大腸桿菌對慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟 沙星敏感的標(biāo)準(zhǔn)分別為抑菌圈直徑大于等于15mm、21mm、16mm、17_。
[0027] 所述步驟（3)中混合培養(yǎng)的具體方法為：
[0028] 先量取步驟（2)篩選出的鴨疫里默氏桿菌接種至含4%血清的胰蛋白胨大豆肉湯 養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150r/min、溫度為37°C的搖床上振蕩培養(yǎng)14-18h，至培養(yǎng)基見渾濁時，再 將步驟（2)篩選出的大腸桿菌接種于上述培養(yǎng)基中混合，在轉(zhuǎn)速為150r/min、溫度為37°C 的搖床上振蕩培養(yǎng)9-12h，制得混合培養(yǎng)菌液。
[0029] 所述步驟（3)中混合培養(yǎng)的具體方法為：
[0030] (3-1)量取步驟（2)篩選出的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌，將量取的鴨疫里默氏 桿菌接種至含4%血清的胰蛋白胨大豆肉湯養(yǎng)基中，將量取的大腸桿菌接種至胰蛋白胨大 豆肉湯培養(yǎng)基中；
[0031] (3-2)將步驟（3-1)中分別接種鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌的培養(yǎng)基分別在轉(zhuǎn)速 為150r/min、溫度為37°C的搖床上振蕩培養(yǎng)16-20h ;
[0032] (3-3)將步驟（3-2)搖床振蕩培養(yǎng)得到的鴨疫里默氏桿菌菌液稀釋至 15 X 10sCFU/ml，大腸桿菌菌液稀釋至I. 5 X IO3CFlVml ;
[0033] (3-4)吸取步驟（3-3)中制得的50 μ 1稀釋后的鴨疫里默氏桿菌菌液與10 μ 1稀 釋后的大腸桿菌菌液，并同時接種于4ml含4%血清的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速 為150r/min、溫度為37°C的搖床上振蕩培養(yǎng)9-12h，制得混合培養(yǎng)菌液。
[0034] 所述步驟（4)測定篩選出的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌對抗生素的最小抑菌濃 度的試驗方法為試管雙倍稀釋法。
[0035] 所述步驟（5)制得的抗生素平板培養(yǎng)基為含4%血清的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng) 基，對應(yīng)選用的各抗生素，培養(yǎng)基中加入該抗生素的濃度分別為：慶大霉素10 μ g/ml，環(huán)丙 沙星3 μ g/ml，氧氟沙星6 μ g/ml，諾氟沙星6 μ g/ml。
[0036] 所述步驟（6)分離混合培養(yǎng)菌液的具體方法為：
[0037] 將步驟⑶制得的適量混合培養(yǎng)菌液稀釋至3 X 103-6 X 103CFU/ml后，吸取100 μ 1 稀釋液，涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、含4%血清的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基以及步驟（5)制 得的含慶大霉素的抗生素平板培養(yǎng)基中，置于CO2培養(yǎng)箱37°C下培養(yǎng)20-24h，即可對混合 培養(yǎng)菌液中的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌進行分離。
[0038] 本發(fā)明鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)及重新分離的方法，通過藥物敏感性 試驗篩選出對某種抗生素耐藥的鴨疫里默氏桿菌，以及對該抗生素敏感的大腸桿菌，并采 用試管雙倍稀釋法測定篩選出的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌對該抗生素的最小抑菌濃度， 然后將篩選出的鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌以一定的時間間隔或者不同的濃度接種于含 4%血清的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，即可對鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌進行混合培養(yǎng)。 將混合培養(yǎng)的菌液稀釋分別涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、含4%血清的胰蛋白胨大豆瓊脂培 養(yǎng)基以及制得的含抗生素的抗生素平板培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，即可對這兩種細(xì)菌實施再次分 離。本發(fā)明提供的一種鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌在體外混合培養(yǎng)以及重新分離的方法， 操作簡單，在鴨禽體外使兩種菌能夠共同生長20代以上，為探討二者在共生條件