一種耐鹽耐有機(jī)溶劑的低溫堿性酯酶EstSL3及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種耐鹽耐有機(jī)溶劑的低溫堿性 酯酶EstSL3及其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酯酶（Esterase E. C. 3. I. I. 1)是一種催化酯鍵水解和合成的酶的總稱。水解時(shí) 催化酯鍵產(chǎn)生醇類和羧酸，合成時(shí)脫水縮合酸的羧基與醇的羥基形成酯及其他香料產(chǎn)品。 酯酶的催化反應(yīng)過程中對(duì)底物具有較高催化特異性，其反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少且不需要 輔酶，在工業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境治理方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 產(chǎn)酯酶生物在自然界中分布非常廣泛，從動(dòng)植物的組織中到不同環(huán)境的微生 物中都普遍存在。微生物酯酶具有來源廣、種類多、反應(yīng)條件溫和、穩(wěn)定性好、底物專 一、催化活性高等特點(diǎn)，是工業(yè)用酯酶的主要來源。從分類上看主要來源于真菌，包括 青霉、紅曲霉、黑曲霉等；其次細(xì)菌，包括芽孢桿菌屬、伯克霍爾德菌屬等；個(gè)別種類的酵 母菌及放線菌屬也能產(chǎn)生一些的酯酶。其中一些具有工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值的己被使用，如來 自于黑曲霉、根霉arrAizi/s)、毛霉菌（ifi/corep.)、根毛霉 (熱_/沉鹽/corep.)、焚光假單胞菌/7?/(λΓ6>6·6>6?6·)、假絲酵母sp.)等 微生物的酯酶。
[0004] 微生物酯酶在食品加工、洗滌劑、化工用品、環(huán)保等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。例 如，在食品加工上，酯酶可應(yīng)用于改善啤酒、白酒及其他飲品的風(fēng)味，如在啤酒工藝生產(chǎn)中 使用酵母菌的酯酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶，在兩者的共同作用下，產(chǎn)生酯酸異戊酯，可以增進(jìn)啤酒的 風(fēng)味。在精細(xì)化工品方面，其酯轉(zhuǎn)換和合成反應(yīng)可制備具有經(jīng)濟(jì)效益的日用化學(xué)品，酯酶催 化糖酯等重要的生物表面活性劑的合成。及手性藥物生產(chǎn)方面，主要應(yīng)用?；D(zhuǎn)移及水解 作用合成藥物。
[0005] 極端環(huán)境來源的微生物能夠產(chǎn)生一些極端酶，這些酶在極端條件下具有很高的酶 活性，因此能夠適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)中苛刻的條件而具有巨大的應(yīng)用前景?，F(xiàn)在研究較多的是嗜 熱酶，嗜堿酶，嗜酸酶，嗜冷酶，嗜鹽酶等。其中嗜冷酶由于其在低溫條件下具有高活性而且 反應(yīng)過程容易控制而受到越來越多的研究。此外，能夠適應(yīng)多種極端條件的酶也受到越來 越多的關(guān)注。
[0006] 目前所獲得的酯酶大多數(shù)來源于常規(guī)環(huán)境，最適溫度在40°C左右，最適pH為中性 偏堿性，在很多工業(yè)中沒法應(yīng)用。鹽堿湖是一個(gè)天然的穩(wěn)定的堿性環(huán)境，pH在9-11之間， 有時(shí)會(huì)達(dá)到12左右，通常同時(shí)具有中高度的鹽存在因此。鹽堿湖中存在大量的嗜鹽堿微生 物。而且從這些分離的嗜鹽堿微生物中獲得了具有工業(yè)價(jià)值的堿性酶如堿性蛋白酶、堿性 纖維素酶、堿性淀粉酶等。
[0007] 本發(fā)明從鹽堿湖中分離了 一株能夠產(chǎn)低溫堿性耐鹽酯酶的菌株嗜鹽嗜堿菌 (兒sp. SL3)，利用分子生物學(xué)和基因工程的方法獲得了該低溫耐鹽堿性 酯酶的編碼基因，并對(duì)該基因進(jìn)行了重組表達(dá)，重組酶具有低溫(最適溫度30°C，(TC還具有 70%左右的酶活)，堿性(最適pH 9.0)。該酶還具有很好的鹽的耐受性和穩(wěn)定性（5M NaCl處 理2h還剩88%的酶活)。此外，該酶對(duì)一些金屬離子、常見的有機(jī)溶劑以及洗滌劑具有較好 的抗性。酯酶EstSL3具有低溫、堿性、耐鹽、耐洗滌劑和耐有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，可應(yīng)用于精細(xì) 化工、制藥、洗滌劑以及食品等工業(yè)領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明一種耐鹽耐有機(jī)溶劑的低溫堿性酯酶EstSL3及其基因和應(yīng)用，首先所要 解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在精細(xì)化工、制藥， 洗滌劑和食品工業(yè)中應(yīng)用的新酯酶。本發(fā)明獲得一種低溫堿性耐鹽耐有機(jī)溶劑的酯酶 EstSL3,在低溫堿性及高鹽條件下具有很高的酶活，而且該酶對(duì)一些常見的有機(jī)溶劑、化學(xué) 試劑以及洗滌劑具有較好的抗性。這些性質(zhì)符合食品工業(yè)，精細(xì)化工以及制藥工業(yè)的的要 求，降低能耗，增加產(chǎn)物得率，優(yōu)化生產(chǎn)過程。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 本發(fā)明提供了一種低溫堿性耐鹽耐有機(jī)溶劑酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。
[0010] 本發(fā)明提供了編碼上述低溫堿性耐鹽耐有機(jī)溶劑酯酶基因。具體地，該基 因的基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本發(fā)明還提供了包含上述低溫堿性耐鹽耐有機(jī)溶劑酯酶重組載體，優(yōu) 選為 pET28a_estSL3。
[0012] 本發(fā)明還提供了包含上述低溫堿性耐鹽耐有機(jī)溶劑的酯酶EstSL3的重組菌株， 優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌和絲狀真菌。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種制備低溫堿性耐鹽耐有機(jī)溶劑酯酶EstSL3的方法，包括以 下步驟： 1) 用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組酯酶表達(dá)；以及 3) 回收并純化所表達(dá)的酯酶EstSL3。
[0014] 本發(fā)明還提供了上述低溫堿性耐鹽耐有機(jī)溶劑酯酶EstSL3的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、 適合于在精細(xì)化工、制藥，洗滌劑和食品工業(yè)中應(yīng)用的新酯酶。本發(fā)明獲得一種低溫堿性耐 鹽耐有機(jī)溶劑的酯酶EstSL3,在低溫堿性及高鹽條件下具有很高的酶活，而且該酶對(duì)一些 常見的有機(jī)溶劑、化學(xué)試劑以及洗滌劑具有較好的抗性。這些性質(zhì)符合食品工業(yè)，精細(xì)化工 以及制藥工業(yè)的的要求，降低能耗，增加產(chǎn)物得率，優(yōu)化生產(chǎn)過程。
[0016] 本發(fā)明所述低溫堿性耐鹽耐有機(jī)溶劑的酯酶EstSL3可得自大布蘇鹽堿湖底泥分 離的嗜鹽嗜堿菌（J從aJiAacterii/a? sp.)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示： MKINKNDTLLFIGDSITDVGRDRMDGEDLGKGFPLMVASHLQSRYPAKRLTVLNRGIG⑶SLKDLKRRWED DCLITNPDIVTLLIGVNDTWRNQNDGVELTDEELDEFESDYRFLLKSLHQRTDARVILMESFVLPYPKRRVGWRND LDKRIQIVRKMARDYQTELIPLDGLLNAAGIRDGFSYYTCDDGVHPTVAGHGLIANSWLKAVDE。
[0017] 本發(fā)明的酯酶EstSL3總共含211個(gè)氨基酸，N端無預(yù)測(cè)的信號(hào)肽，理論分子量為 24. 04 kDa，理論等電點(diǎn)為5. 28。
[0018] 本發(fā)明的酯酶EstSL3的最適pH為9. 0，EstSL3的表觀最適pH為9. 0,當(dāng)pH小 于6.0酶活性急劇下降，在pH5.0時(shí)，基本檢測(cè)不到酶活性。該酯酶在pH 6.0-10.0之間 均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在80%以上，這說明此酶具有較好的 pH穩(wěn)定性。
[0019] 本發(fā)明的酯酶EstSL3的最適溫度為30°C，在0°C時(shí)剩余70%左右的酶活。在50 °C下穩(wěn)定，處理60 min后仍能保持90 %以上的活性。在60°C下不穩(wěn)定，半衰期小于 5min〇
[0020] 本發(fā)明的酯酶EstSL3還具有很好的鹽的耐受性和穩(wěn)定性。在0.5-4.0 M NaCl 存在的情況下剩余98%以上的酶活。在4 M和5M NaCl的濃度下處理60 min,剩余88%以 上的酶活。表明該酯酶對(duì)鹽具有非常好的耐受性和穩(wěn)定性。
[0021] 1^ +，恥+，1(+，]\%2+，〇32^〇了4和0116代3?仂6也311〇1在低濃度和高濃度的情況下 均能夠促進(jìn)酶活；Co2+，Zn2+，Mn2+和Cu2+對(duì)酶有部分抑制作用；Ag +，F(xiàn)e2+，Hg2+和Pb 2++對(duì)酶活 力有強(qiáng)烈抑制。
[0022] 低濃度的Tween 80和Triton X-100對(duì)EstSL3有促進(jìn)作用，其中1% Tween 80促 進(jìn)作用最為明顯，可達(dá)131%左右；而高濃度下對(duì)EstSL3有部分抑制作用。低濃度的Tween 20和SDS對(duì)酶有部分抑制作用；而高濃度下對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用。
[0023] 10%與20%的乙醇、丙醇、正己烷對(duì)酶活影響不大，酶活仍能保持在90%以上。甲 醇、甘油、乙腈則對(duì)酶活具有輕微的抑制作用。低濃度的丁醇、異丁醇、丙酮、氯仿對(duì)酶活影 響不大，而當(dāng)濃度為20%具有明顯抑制作用，酶活為50%以下。
[0024] 本發(fā)明還提供了編碼上述低溫堿性耐鹽耐有機(jī)溶劑的酯酶EstSL3的基因 ￡^?5Zl?該基因序列如SEQIDN0.2所示(其在NCBI中的登錄號(hào)為KT225466): ATGAAAATCAACAAGAATGATACGTTGCTGTTCATCGGTGACAGCATAACAGATGTAGGCCGTGACCGTAT GGATGGCGAAGATTTAGGTAAGGGATTCCCATTGATGGT