一種尿嘧啶dna糖苷酶、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種尿嘧啶DNA糖苷酶、制備方法及其 應用。
【背景技術】
[0002] 核酸體外擴增技術作為分子生物學和基因工程技術的基石，極大的促進了現(xiàn)在生 命科學研究的發(fā)展。PCR作為一種最為常見的高效核酸擴增技術，其出現(xiàn)使得體外快速制備 特定DNA分子成為可能，目前廣泛應用于各種核酸擴增與檢測領域，極大地促進了核酸診 斷技術、現(xiàn)代基因工程、重組蛋白質(zhì)工程的發(fā)展。為了進一步改善PCR性能，目前開發(fā)了多 種新型PCR擴增技術。其中PCR反應體系優(yōu)化，例如通過加入二甲基亞砜（DMSO)、優(yōu)化鎂離 子濃度等，能夠在一定程度上改善PCR性能，但也存在通用性、重復性差等問題，特別是更 換目的基因片段后，通常需要重新優(yōu)化這些PCR反應條件。另外，熱啟動DNA聚合酶通過抑 制常溫下的酶活性，減弱非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體等副產(chǎn)物，增加目的DNA擴增產(chǎn) 量。
[0003] 在PCR過程中，高溫會使4種脫氧核苷三磷酸中的脫氧胞嘧啶核苷三磷酸（dCTP) 水解脫氨，生成脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP)，其被DNA聚合酶摻入新合成的DNA分子中后 以尿嘧啶堿基形式存在，尿嘧啶堿基嚴重抑制B型DNA聚合酶活性，最終降低DNA有效擴增 長度和擴增產(chǎn)量。鑒于各種高忠實性的B型DNA聚合酶在PCR中廣泛使用，因此必須解決 這一問題，從而提高B性DNA聚合酶的擴增性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服B型DNA聚合酶活性受尿嘧啶堿基嚴重抑制的問題，本發(fā)明的目的在于 提供一種尿嘧啶DNA糖苷酶、制備方法及其應用；本發(fā)明的尿嘧啶DNA糖苷酶使其廣泛應用 于各種B型DNA聚合酶的PCR擴增實例中。該PCR擴增技術具有通用性廣、綜合性能優(yōu)良 等特點；不僅能顯著提高多種商品化DNA聚合酶的PCR產(chǎn)量，還可以增加 PCR擴增片段有效 擴增長度。
[0005] 本發(fā)明對各種B型DNA聚合酶的PCR擴增技術的改善原理在于：尿嘧啶DNA糖苷 酶能將DNA分子中的尿嘧啶堿基從脫氧核糖上水解切除，從而消除DNA中尿嘧啶對DNA聚 合酶的抑制作用，提高PCR產(chǎn)量和DNA有效擴增長度。
[0006] 本發(fā)明的技術方案具體如下。本發(fā)明提供一種尿嘧啶DNA糖苷酶，其為嗜熱微生 物的尿啼啶DNA糖苷酶；所述嗜熱微生物為火球菌（Pyrococcus furiosus)或敏捷氣熱菌 (Aeropyrum pernix);其中：火球菌的尿啼啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所 示；敏捷氣熱菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0007] 本發(fā)明還提供一種編碼上述尿嘧啶DNA糖苷酶的基因，編碼火球菌的尿嘧啶DNA 糖苷酶的基因如SEQ ID NO: 1所示；編碼敏捷氣熱菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的基因如SEQ ID NO: 2所示。
[0008] 本發(fā)明進一步提供一種尿嘧啶DNA糖苷酶的制備方法，具體步驟如下：
[0009] (1)構(gòu)建尿嘧啶DNA糖苷酶的重組表達質(zhì)粒
[0010] 基于嗜熱微生物編碼的尿嘧啶DNA糖苷酶基因序列，設計引物，擴增基因，并將基 因克隆到原核表達載體PET28,構(gòu)建尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達質(zhì)粒；
[0011] (2)重組表達尿嘧啶DNA糖苷酶
[0012] 將構(gòu)建的尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主BL21 (DE3)，得 到尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達菌株；再將其用誘導劑IPTG進行菌尿嘧啶DNA糖苷酶誘導表 達；
[0013] (3)親和純化表達的尿嘧啶DNA糖苷酶
[0014] 離心收集誘導表達尿嘧啶DNA糖苷酶后的大腸桿菌，將菌體重懸于非變性蛋白裂 解液，超聲波破碎菌體，加熱失活大腸桿菌自身蛋白，離心收集含有尿嘧啶DNA糖苷酶的大 腸桿菌裂解上清液；再利用固定化鎳離子親和純化樹脂從上清液中分別純化尿嘧啶DNA糖 苷酶；
[0015] (4)檢測尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和熱穩(wěn)定性。
[0016] 將純化后尿嘧啶DNA糖苷酶進行酶活性和熱穩(wěn)定性檢測，從中篩選出95°C下特異 性切除尿嘧啶堿基的酶活性半衰期不低于30分鐘的尿嘧啶DNA糖苷酶。
[0017] 上述步驟（1)中，所述嗜熱微生物為火球菌或敏捷氣熱菌。
[0018] 上述步驟（2)中用誘導劑IPTG進行誘導培養(yǎng)的具體條件為：先將尿嘧啶DNA糖苷 酶重組表達菌株培養(yǎng)至〇D6。。= 0. 4-1. 0,再加入0. 5mM誘導劑IPTG在37°C溫度下培養(yǎng)3小 時或22°C溫度下培養(yǎng)12小時進行誘導表達。
[0019] 上述步驟⑶中，所述非變性蛋白裂解液的組成如下：20mM pH值為8.0的 Tris-HCl, 300mM NaCl，0.5mM DTT，10vol%甘油。
[0020] 本發(fā)明還進一步提供上述的尿嘧啶DNA糖苷酶于B型DNA聚合酶的PCR擴增技術 中的應用；優(yōu)選的，所述B型DNA聚合酶為Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶或Vent DNA聚 合酶。
[0021] 上述應用時的具體方法如下：在B型DNA聚合酶催化的PCR反應體系中加入尿嘧 啶DNA糖苷酶，擴增目標基因。利用1 %瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增結(jié)果，測定尿嘧啶DNA糖 苷酶對PCR的改良效果。
[0022] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0023] (1)通用性好，由于尿嘧啶DNA糖苷酶針對DNA中尿嘧啶堿基對DNA聚合酶活性的 抑制缺陷，進行改良設計；因此能夠顯著改善所有B型DNA聚合酶的PCR擴增性能，并不局 限于某一 DNA聚合酶，能夠顯著改良多種商品化B型DNA聚合酶的PCR擴增產(chǎn)量和DNA有 效擴增長度。
[0024] (2)尿嘧啶DNA糖苷酶不僅能夠增加 PCR擴增產(chǎn)量，還能夠增加 DNA有效擴增長 度，特別適用于長片段DNA的PCR擴增。
【附圖說明】
[0025] 圖1是火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活測定圖。
[0026] 圖2是火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的熱穩(wěn)定性圖。
[0027] 圖3是火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶對Pfu DNA聚合酶催化PCR的促進作用圖示。
[0028] 圖4是火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶對KOD DNA聚合酶催化PCR的促進作用圖示。
[0029] 圖5是敏捷氣熱菌尿嘧啶DNA糖苷酶對Vent DNA聚合酶催化PCR的促進作用圖 不。
【具體實施方式】
[0030] 以下通過實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細描述。以下實施例不構(gòu)成對本 發(fā)明的限定。
[0031 ] 實施例1火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的制備
[0032] 第一步，設計合成火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表達載體，構(gòu)建尿 嘧啶DNA糖苷酶的重組表達質(zhì)粒。重組火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶N端帶有來源于pET28載 體的6個連續(xù)組氨酸親和純化標簽，用于固定化鎳離子親和層析純化。
[0033] 火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的基因序列如SEQ ID NO :1所示。
[0034] 第二步，重組表達火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶。將火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶重組表 達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主BL21 (DE3)，得到火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達菌株。將 表達菌株培養(yǎng)至0D6。。= 0. 6,加入0. 5mM誘導劑IPTG，在37°C溫度下培養(yǎng)3小時，誘導尿嘧 啶DNA糖苷酶表達。
[0035] 火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶重組蛋白的氨基酸序列（氮端一碳端）如SEQ ID NO: 3 所示