Bst DNA聚合酶在RNA擴(kuò)增中的應(yīng)用
【專利說明】
【背景技術(shù)】
[0001]RNA是基因組中遺傳信息表達(dá)的核心和關(guān)鍵，也是生命科學(xué)研究的重要對象，對RNA研究的目的、技術(shù)手段等雖然各不相同，但獲取足夠的量進(jìn)行后續(xù)研究卻是共同的要求。隨著許多先進(jìn)實驗儀器設(shè)備以及技術(shù)方法的應(yīng)用，RNA的擴(kuò)增手段越來越多，但生物醫(yī)學(xué)、檢驗檢疫等方面對RNA的快速擴(kuò)增提出了更高的要求，使之更滿足現(xiàn)場檢測的需要。
[0002]RNA擴(kuò)增是以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再在cDNA的基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)增。目前，擴(kuò)增RNA的常用方法有反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)、指數(shù)鏈置換技術(shù)(exponential SDA)、改良的侵入擴(kuò)增反應(yīng)(modified invaderamplificat1n)、發(fā)夾介導(dǎo)的二次酶擴(kuò)增和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)等，但這些方法大多涉及反轉(zhuǎn)錄過程，即引物在反轉(zhuǎn)錄酶(AMV、MMLV等)的作用下以RNA為模板產(chǎn)生cDNA鏈，這也是目前RNA擴(kuò)增最關(guān)鍵的一步。
[0003]現(xiàn)有的RNA檢測實驗存在反轉(zhuǎn)錄和后續(xù)擴(kuò)增兩個步驟，以RT-PCR為例，提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。
[0004]反轉(zhuǎn)錄酶的最佳反應(yīng)條件為42°C保溫60min，而42°C時，RNA的二級結(jié)構(gòu)難以被打開，需要先在70°C保溫5min后立即冰浴，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，第二步以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板的擴(kuò)增實驗所用的酶也有溫度要求，兩者難以進(jìn)行溫度的統(tǒng)一，得到在同一溫度下反應(yīng)的最佳檢測條件。因此現(xiàn)有的RNA擴(kuò)增檢測方法存在反應(yīng)時間長、操作步驟復(fù)雜等限制，無法滿足RNA快速檢測的需求。
[0005]Bst DNA聚合酶大片段是BaciIIus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，具有Y -3r DNA聚合酶活性，但缺失5 ^ — 3 ^核酸外切酶活性。Bst DNA聚合酶大片段最主要的特性是具有超強的鏈置換功能(strand displacement)，可用于要求嗜溫鏈置換的等溫擴(kuò)增實驗，富含GC區(qū)域的DNA測序，納克級含量DNA模板的快速測序。需要注意的是，此酶建議反應(yīng)溫度不要超過70°C，不能用于熱循環(huán)測序或PCR。長期貯存需加入100 μ g/mlBSA 或 0.1% Triton X-1OO0
[0006]Bst 2.0 DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶，大片段的同源物，并由電腦模擬設(shè)計完成。Bst 2.0 DNA聚合酶具有Y - 3r的聚合酶活性和強鏈置換活性，但沒有Y - 3r核酸外切酶活性。和野生型Bst DNA聚合酶，大片段相比，該酶可有效提高擴(kuò)增速度、產(chǎn)量、耐鹽性和熱穩(wěn)定性等。來源于E.coli菌株，該菌株攜帶有誘導(dǎo)啟動子，可表達(dá)Bst 2.0 DNA聚合酶蛋白。
[0007]Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶在等溫聚合酶中是獨有的。像“熱啟動”PCR聚合酶一樣，這種特性在低于最適反應(yīng)溫度下可以抑制酶活性。因此，實驗操作可以在室溫下進(jìn)行而不至于引發(fā)非特異性反應(yīng)。
[0008]單位定義:65°C條件下，30分鐘內(nèi)使1nmol的dNTP摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定義為I個活性單位。
[0009]活性檢測條件:50mMKCl, 20mM Tris-HCl (pH 8.8)，10mM MgCl2,30nMM13mpl8ssDNA, 70nM M13 測序引物(-47)24mer, 200 μ M dATP, 200 μ M dCTP, 200 μ MdGTP, 100 μ M[3H] dTTP, 100 μ g/ml BSA 和酶，65°C溫育。Bst DNA 聚合酶除了其最佳緩沖溶液外，根據(jù)后續(xù)擴(kuò)增實驗需要的其他緩沖溶液也有一定的活性，例如NEBufTer3.1。
[0010]貯存條件:50mMKCl, 1mM Tris-HCl (pH 7.5)，ImM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1 %Triton X-1OO 和 50%甘油。貯存于 _20°C。
[0011]熱失活:80°C，20min。
[0012]Bst DNA 聚合酶包括 Bst DNA 聚合酶大片段(Bst large fragment DNApolymerase)，Bst 2.0 DNA 聚合酶(Bst 2.0 DNA polymerase)，Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase)
[0013]Bst DNA聚合酶還包括Bst DNA聚合酶大片段為主體突變而成的新酶，或與其他配體結(jié)合成的新酶，其催化主體為Bst DNA聚合酶大片段。以下統(tǒng)一簡稱為Bst DNA聚合酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明針對現(xiàn)有RNA擴(kuò)增檢測技術(shù)上的不足，以新發(fā)現(xiàn)的Bst DNA聚合酶可以反轉(zhuǎn)錄RNA的特性，提出了對RNA擴(kuò)增的新應(yīng)用，解決現(xiàn)有RNA擴(kuò)增技術(shù)中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)過程復(fù)雜，時間長，成本高的問題。
[0015]Bst DNA聚合酶在RNA擴(kuò)增中的應(yīng)用，所述Bst DNA聚合酶具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，使RNA在其作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0016]所述Bst DNA聚合酶具備反轉(zhuǎn)錄功能時的最佳反應(yīng)條件為:1X等溫擴(kuò)增緩沖液[20mM Tris-HCl(pH 8.8i25°C )，50mM KCl，1mM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4,0.1% Tween-20],據(jù)后續(xù)擴(kuò)增實驗其他酶的需要，也可以選擇其他的緩沖溶液，如NEBuffer3.1。
[0017]所述Bst DNA聚合酶具有反轉(zhuǎn)錄活性時的適宜溫度為55-72 °C，優(yōu)選的55?65 °C。
[0018]反轉(zhuǎn)錄的模板RNA長度為:小于262nt，優(yōu)選的50_125nt。
[0019]根據(jù)所述Bst DNA聚合酶的反轉(zhuǎn)錄活性，RNA擴(kuò)增的方法，步驟如下:
[0020](I)、以目標(biāo)RNA為模板，加入Bst DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;進(jìn)一步的，所述反轉(zhuǎn)錄合成溫度為55?65°C，所述Bst DNA聚合酶加入量為反應(yīng)體系的1/200。
[0021 ] (2)、以步驟I所得的cDNA為模板，加入DNA聚合酶，擴(kuò)增cDNA的數(shù)量以實現(xiàn)目標(biāo)RNA的擴(kuò)增。
[0022]進(jìn)一步的，所述RNA擴(kuò)增的方法為等溫擴(kuò)增，步驟如下:
[0023](I)、以目標(biāo)RNA為模板，加入Bst DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;進(jìn)一步的，所述反轉(zhuǎn)錄合成溫度為55?65°C，所述Bst DNA聚合酶加入量為反應(yīng)體系的1/200。
[0024](2)、以步驟I所得的cDNA為模板，加入Bst DNA聚合酶，擴(kuò)增cDNA的數(shù)量以實現(xiàn)目標(biāo)RNA的擴(kuò)增。
[0025]所述等溫擴(kuò)增時IX NEBuffer3.1 為 10mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 1mMMgC12, 100 μ g/ml BSA(pH 7.9@25°C )。根據(jù)具體擴(kuò)增實驗，緩沖溶液也可以為NEBuffer 1，NEBuffer 2，等溫緩沖溶液等。
[0026]所述方法根據(jù)Bst DNA聚合酶兼具反轉(zhuǎn)錄活性與聚合酶活性，直接在RNA革E標(biāo)上進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增，使得整個體系完全在等溫條件下一步進(jìn)行，無需反轉(zhuǎn)錄酶的加入，使反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增實現(xiàn)一體化，減少了酶的用量，且縮短了反應(yīng)時間。
[0027]有益效果:
[0028](I)本發(fā)明以Bst DNA聚合酶具有反轉(zhuǎn)錄酶活性這一新發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了新的RNA擴(kuò)增檢測新方法，所述方法將反轉(zhuǎn)錄與后續(xù)核酸擴(kuò)增融為一體，全過程無需對溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，不需要添加額外的反轉(zhuǎn)錄酶，操作簡單，縮短反應(yīng)時間，為RNA反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增檢測提供了新的方法學(xué)參考和技術(shù)支持。
[0029](2)發(fā)現(xiàn)的Bst DNA聚合酶可以在較高的溫度下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，這有助于打開和結(jié)合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA，從而解決了 AMV等反轉(zhuǎn)錄酶難以擴(kuò)增RNA高級結(jié)構(gòu)區(qū)域的問題。
【附圖說明】
[0030]圖1非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳反轉(zhuǎn)錄驗證圖
[0031]其中，泳道M:20bp DNA Marker ;泳道 1:750nM 的 RNA 模板；泳道 2:750nM 的 RNA模板，750nM的反轉(zhuǎn)錄引物；泳道3 =AMV反轉(zhuǎn)錄酶參與的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)；泳道4:Bst DNA聚合酶大片段參與的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)
[0032]圖2 HCV - RNA (50nt) RT-PCR 結(jié)果圖
[0033]其中，曲線1:Bst 2.0 DNA聚合酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線2:Bst 2.0ffarmStartDNA聚合酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線3:Bst DNA聚合酶大片段參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線4:AMV反轉(zhuǎn)錄酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線5 =Blank (即以水為模板進(jìn)行的PCR)
[0034]圖3 大腸桿菌(K-12) 16S rRNA (65nt) RT-PCR 結(jié)果圖
[0035]其中，曲線1:Bst 2.0 DNA聚合酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線2:Bst 2.0ffarmStartDNA聚合酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線3:Bst DNA聚合酶大片段參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線4:AMV反轉(zhuǎn)錄酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線5 =Blank (即以水為模板進(jìn)行的PCR)
[0036]圖4 大腸桿菌(K-12) 16S rRNA (125nt) RT-PCR 結(jié)果圖
[0037]其中，曲線1:Bst 2.0 DNA聚合酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線2:Bst 2.0ffarmStartDNA聚合酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線3:Bst DNA聚合酶大片段參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線4:AMV反轉(zhuǎn)錄酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線5 =Blank (即以水為模板進(jìn)行的PCR)
[0038]圖5 大腸桿菌(K-12) 16S rRNA (262nt) RT-PCR 結(jié)果圖
[0039]其中，曲線1:Bst 2.0 DNA聚合酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線2:Bst 2.0ffarmStartDNA聚合酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線3:Bst DNA聚合酶大片段參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線4:AMV反轉(zhuǎn)錄酶參與的RT-PCR反應(yīng)；曲線5 =Blank (即以水為模板進(jìn)行的PCR)
[0040]圖6大腸桿菌(K-12) 16S rRNA不同長度RT-PCR結(jié)果圖
[0041]其中，泳道M:20 bp DNA Marker ;泳道1:AMV反轉(zhuǎn)錄酶參與的模板為65nt的RT-PCR ;泳道2:Bst DNA聚合酶，大片段參與的模板為65nt的RT-PCR ;泳道3 =AMV反轉(zhuǎn)錄酶參與的模板為125nt的RT-PCR ;泳道4:Bst DNA聚合酶，大片段參與的模板為125nt的RT-PCR ;泳道5 =AMV反轉(zhuǎn)錄酶參與的模板為262nt的RT-PCR ;泳道6:Bst DNA聚合酶，大片段參與的模板為262nt的RT-PCR ;泳道7:以水模板進(jìn)行PCR
[0042]圖7.不同濃度cDNA熒光信號，由Bst 2.0聚合酶反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋不同濃度進(jìn)行實時熒光定量RCR的結(jié)果圖
[0043]其中，曲線1:1.0pmol cDNA作為模板進(jìn)行PCR ;曲線2:100fmol cDNA作為模板進(jìn)行PCR ;曲線3:1Ofmol cDNA作為模板進(jìn)行PCR ;曲線4:1.0fmol cDNA作為模板進(jìn)行P