一種快速提取全血基因組dna的裝置及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速提取全血基因組DNA的裝置及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸是以核苷酸為基本單位的重要生物分子，廣泛存在于所有動(dòng)物、植物細(xì)胞、微生物及生物體內(nèi)。不同的核酸，其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同。根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。核酸是一切生物細(xì)胞的基本成分，也對(duì)生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳及變異等重大生命現(xiàn)象起主宰作用。核酸在實(shí)踐應(yīng)用方面有極重要的作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多遺傳性疾病、腫瘤的發(fā)生、病毒的感染、射線對(duì)機(jī)體的作用等都與核酸有關(guān)。因此，對(duì)核酸結(jié)構(gòu)、功能與調(diào)控的認(rèn)識(shí)是人類(lèi)在分子水平研究遺傳、進(jìn)化和疾病診斷的基礎(chǔ)。目前，核酸研究已成為生命科學(xué)中的與多學(xué)科廣泛交叉、滲透的研究熱點(diǎn)及發(fā)展前沿。核酸抽提是許多臨床、法醫(yī)學(xué)應(yīng)用及遺傳學(xué)分析的前提，通過(guò)DNA或RNA的提取及純化過(guò)程，消除或減小其他雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、多糖及脂肪等)對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的影響。傳統(tǒng)的DNA提取方法是自1950年后相繼發(fā)展起來(lái)的固相萃取法(Solid-Phase Extract1n，SPE)和液-液萃取法(酚氯仿法)。這些方法操作步驟繁瑣，所使用的提取試劑具有毒害性，限制了其在臨床上的推廣應(yīng)用。目前普遍使用的硅膠膜離心柱法，雖簡(jiǎn)化了操作步驟，但大片段DNA強(qiáng)力結(jié)合于膜上，難洗脫，導(dǎo)致離心過(guò)柱時(shí)DNA易斷裂，影響下游實(shí)驗(yàn)包括測(cè)序、克隆、PCR、轉(zhuǎn)化、微注射、轉(zhuǎn)染和微陣列分析。靜脈血為目前普遍用于全血基因組DNA提取的樣本，靜脈采血可能發(fā)生皮下出血或局部紅腫、局部皮膚過(guò)敏反應(yīng)、誤穿刺入動(dòng)脈及采血失敗等并發(fā)癥。此外，嬰幼兒靜脈采血難度比較大，因此，亟需開(kāi)發(fā)一種快速、高效、適合于臨床床旁檢測(cè)的微量全血基因組的提取裝置和方法。微流控芯片技術(shù)是指操作微小網(wǎng)絡(luò)通道中流體的科學(xué)技術(shù)。與常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)相比，此技術(shù)極大降低了試劑的消耗量、降低成本同時(shí)產(chǎn)生極少的廢液，而且在微流體通道中，傳熱、傳質(zhì)速度比常規(guī)體系快，反應(yīng)時(shí)間或分析時(shí)間都大大縮短。目前，許多研究利用微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)了微量全血基因組DNA的提取，但都需特殊輔助設(shè)備，仍采用靜脈血作為檢測(cè)樣本，不能實(shí)現(xiàn)末梢全血基因組DNA提取的POCTo

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題提出的一種集末梢血采集，全血基因組核酸提取及純化的裝置和相應(yīng)方法，實(shí)現(xiàn)微量全血基因組DNA的快速、高效提取。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0005]—種快速提取全血基因組DNA的裝置，包括有一體化成型的毛細(xì)采集管、全血細(xì)胞裂解區(qū)、流體控制管，還包括有與所述流體控制管相配合的抽吸裝置，所述全血細(xì)胞裂解區(qū)由聚丙烯絲束填充。
[0006]為了進(jìn)一步完善和優(yōu)化上述的裝置，本發(fā)明采取的技術(shù)措施還包括:
[0007]優(yōu)選地，上述毛細(xì)采集管、全血細(xì)胞裂解區(qū)以及流體控制管均為玻璃材料制作。
[0008]優(yōu)選地，上述抽吸裝置為橡膠滴頭，即膠頭滴管的滴頭。
[0009]優(yōu)選地，還包括能夠密封毛細(xì)采集管的采集管封管器，以及能夠密封流體控制管的控制管封管器。
[0010]優(yōu)選地，上述毛細(xì)采集管長(zhǎng)2-6cm，管壁厚度為0.1-0.4mm,內(nèi)徑為0.5-0.7mm ;更優(yōu)選地，上述毛細(xì)采集管長(zhǎng)度為4cm，內(nèi)徑為0.5mm,外徑為0.7mm,管壁厚度為0.1mm。
[0011]優(yōu)選地，上述流體控制管長(zhǎng)l_3cm，管壁厚度為0.1-0.4mm,內(nèi)徑為1_1.2mm ;更優(yōu)選地，上述流體控制管長(zhǎng)2cm，內(nèi)徑為1mm，外徑為1.2_，管壁厚度為0.1_。
[0012]優(yōu)選地，上述全血細(xì)胞裂解區(qū)管壁厚度為0.1-0.4_，容積為100-130 μ I ;更優(yōu)選地，全血細(xì)胞裂解區(qū)為直徑6mm的圓球形(以外壁計(jì)算)，管壁厚度為0.2mm。
[0013]另一方面，本發(fā)明還提供一種快速提取全血基因組DNA的方法，使用上述裝置進(jìn)行，包括以下步驟:
[0014]步驟一，利用毛細(xì)采集管采集末梢血5-20 μ I，使用抽吸裝置將采集的末梢血吸入全血細(xì)胞裂解區(qū)中；
[0015]步驟二，利用抽吸裝置將10-40 μ I裂解液吸入全血細(xì)胞裂解區(qū)中進(jìn)行細(xì)胞裂解，裂解溫度為56 °C，持續(xù)10分鐘；
[0016]步驟三，利用抽吸裝置將15-60 μ I無(wú)水乙醇吸入全血細(xì)胞裂解區(qū)中。
[0017]步驟四，利用抽吸裝置將100-130 μ I的75%乙醇吸入全血細(xì)胞裂解區(qū)進(jìn)行漂洗，漂洗過(guò)程反復(fù)進(jìn)行2-5次；
[0018]步驟五，利用抽吸裝置將25-100 μ I去離子水吸入全血細(xì)胞裂解區(qū)將DNA洗脫，獲得全血基因組DNA ；
[0019]其中，所述步驟二中裂解液中的組分和濃度為:10mM Tris_Cl，15mM NaCl, 1mMEDTA,0.4% SDS，200 yg/ml 蛋白酶 K。
[0020]為了進(jìn)一步優(yōu)化上述的方法，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括:
[0021]優(yōu)選地，上述步驟一中采集末梢血為10 μ 1，上述步驟二中利用抽吸裝置將20 μ I裂解液吸入全血細(xì)胞裂解區(qū)中進(jìn)行細(xì)胞裂解。
[0022]優(yōu)選地，上述步驟三中利用抽吸裝置將30 μ I無(wú)水乙醇吸入全血細(xì)胞裂解區(qū)中，上述步驟五中利用抽吸裝置將50 μ I去離子水吸入全血細(xì)胞裂解區(qū)將DNA洗脫，獲得全血基因組DNA。
[0023]聚丙烯絲束具有無(wú)毒、無(wú)味，耐熱、化學(xué)性能好，不吸水，常見(jiàn)的酸、堿等有機(jī)溶劑對(duì)它幾乎不起作用等特點(diǎn)。聚丙烯絲束具有多孔隙結(jié)構(gòu)可作為濾材，廣泛作為香煙中濾嘴，對(duì)煙氣中焦油、煙堿(俗稱(chēng)尼古丁 )、一氧化碳等物質(zhì)進(jìn)行吸附過(guò)濾。
[0024]—方面，本發(fā)明采用無(wú)水乙醇沉淀DNA，DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇奪去DNA周?chē)乃肿樱笵NA失水而易于聚合。另一方面，在pH為8的裂解液中，DNA分子帶負(fù)電荷，一定濃度的NaCl使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。因此，乙醇沉淀DNA時(shí)，一定濃度NaCl進(jìn)一步促進(jìn)了 DNA聚合沉淀。DNA吸附在若干疏水性的聚丙烯絲束大孔隙里之后再用75%乙醇漂洗，將鹽、多糖、蛋白等雜質(zhì)被去除，DNA仍然吸附在聚丙烯絲束上。最后，用去離子水進(jìn)行洗脫，溶于水的DNA從聚丙烯絲束上解離，從而得到純化的基因組DNA。
[0025]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果:
[0026]本發(fā)明首次使用聚丙烯絲束/毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)了末梢血基因組DNA提取，本發(fā)明的裝置和方法操作簡(jiǎn)單、效率高，無(wú)需特殊儀器，實(shí)現(xiàn)了基于微流控芯片的全血基因組DNA“樣品進(jìn)-結(jié)果出”的目的，所提取的基因組DNA適合于分子診斷的測(cè)序、雜交、等溫?cái)U(kuò)增等一系列實(shí)驗(yàn)。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為本發(fā)明的一種快速提取全血基因組DNA的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028]圖2為本發(fā)明裝置中全血細(xì)胞裂解區(qū)填充的聚丙烯絲束的單根絲束10微米刻度下的掃描電鏡結(jié)果；
[0029]圖3為本發(fā)明裝置中全血細(xì)胞裂解區(qū)填充的聚丙烯絲束的單根絲束0.2微米刻度下的掃描電鏡結(jié)果；
[0030]圖4為瓊脂糖凝膠電泳分析提取的基因組DNA結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]圖1為本發(fā)明的一種快速提取全血基因組DNA的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，其中的附圖標(biāo)記為毛細(xì)采集管1、全血細(xì)胞裂解區(qū)2、流體控制管3、抽吸裝置4、采集管封管器5、控制管封管器6。
[0032]本發(fā)明提供了一種快速提取全血基因組DNA的裝置，包括有一體化成型的毛細(xì)采集管1、全血細(xì)胞裂解區(qū)2、流體控制管3，還包括有與所述流體控制管3相配合的抽吸裝置4，所述全血細(xì)胞裂解區(qū)2由聚丙烯絲束填充。
[0033]本發(fā)明的裝置主體毛細(xì)管采用玻璃材質(zhì)，經(jīng)毛細(xì)管拉針器制作而成。
[0034]聚丙烯