一種可同步檢測7種魚類病毒的多重pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)病害微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可同步檢測7種魚類病 毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也呈現(xiàn)出養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖技術(shù)的空前 提高，尤其在集約化養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖方面發(fā)展迅速，這給人民的生活帶來了營養(yǎng)和健 康。但在海水經(jīng)濟(jì)魚類的養(yǎng)殖過程中，病毒性疾病的暴發(fā)往往會給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的 危害。淋巴囊腫病毒（lymphocystis disease virus, IXDV)、細(xì)胞腫大病毒屬虹彩病毒 (Megalocytivirus, Mega)、赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒（red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)、傳染性造血器官壞死病毒（infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV)、傳染性膜臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)、病毒性出血敗血癥病毒（viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)和 傳染性鮭魚貧血癥病毒（infectious salmon anaemia virus, ISAV)是養(yǎng)殖魚類主要的病 毒性病原，它們均能引起傳染性、暴發(fā)性疾病，同時(shí)伴隨著高死亡率，給養(yǎng)殖企業(yè)造成嚴(yán)重 的經(jīng)濟(jì)損失，進(jìn)而對整個(gè)產(chǎn)業(yè)帶來傷害。大菱鮮紅體病虹彩病毒（turbot reddish body iridovirus，TRBIV)是細(xì)胞腫大病毒屬虹彩病毒的一個(gè)成員，主要感染我國養(yǎng)殖的大菱鲆。 因此，建立這些病原的快速、有效、低成本的檢測方法，對保障養(yǎng)殖魚類健康、防治疾病發(fā)生 具有重要的意義。
[0003] 針對上述魚類病毒，目前已有一些檢測方法如核酸探針、常規(guī)PCR、RT_PCR、熒光定 量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)等，還有可對17種魚類病原同時(shí)進(jìn)行檢測的尼龍膜基因芯 片方法（中國發(fā)明專利CN201010243398. 3)。這些方法雖然能檢測魚類病毒，但都存在著致 病的缺陷：核酸探針方法檢測靈敏度低，低于IO5拷貝的病毒無法檢出，不能滿足防控疾病 的需求；常規(guī)PCR、RT-PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)等方法，因引物相互干擾， 各病毒基因的擴(kuò)增必須在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行，故通常僅能對一種或幾種病毒進(jìn)行檢測， 無法對上述7種魚類病毒同步、快速檢測，檢測效率低，不能滿足未知病原樣品的多病毒篩 查需求；尼龍膜基因芯片方法雖然可以對17種魚類病原同時(shí)檢測，但其仍依賴常規(guī)PCR和 RT-PCR方法，需要在多個(gè)反應(yīng)管中對病原分別擴(kuò)增，而不是在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)對各病原進(jìn) 行擴(kuò)增，因此工作量大，容易出現(xiàn)操作失誤；且該方法應(yīng)用尼龍膜點(diǎn)雜交技術(shù)對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn) 行檢測，采用肉眼觀察判斷檢測結(jié)果，靈敏度偏低且不易標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)際應(yīng)用范圍有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種可同步檢測7種魚類病毒的多重PCR方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn) 有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明經(jīng)反復(fù)摸索，設(shè)計(jì)出一組病毒特異性的套式PCR引物和通用性的超級引 物，通過富集、加標(biāo)簽、分離、擴(kuò)增等四大步驟，實(shí)現(xiàn)了在一支反應(yīng)管中對7種病毒9個(gè)基因 的同步、高靈敏性、高特異擴(kuò)增。本發(fā)明克服了多重PCR技術(shù)用于魚類病毒檢測時(shí)存在的引 物設(shè)計(jì)困難、反應(yīng)相互干擾、擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確度差等缺點(diǎn)，是現(xiàn)有魚類多病毒同步檢測技術(shù) 的突破。
[0006] 本發(fā)明首先提供一種多重PCR的引物組，其引物的序列分別為SEQ ID NO: 1-36 ;
[0007] 所述的引物組用于制備檢測淋巴囊腫病毒IXDV、細(xì)胞腫大病毒屬虹彩病毒Mega、 赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒RGNNV、傳染性造血器官壞死病毒IHNV、傳染性胰臟壞死病毒 IPNV、病毒性出血敗血癥病毒VHSV、傳染性鮭魚貧血癥病毒ISAV的制品；
[0008] 所述的制品，優(yōu)選為基因芯片；
[0009] 本發(fā)明另一方面提供一種基因芯片，所述的芯片在玻璃片基上固定有用于檢測的 巴囊腫病毒LCDV、細(xì)胞腫大病毒屬虹彩病毒Mega、赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒RGNNV、傳染性 造血器官壞死病毒IHNV、傳染性膜臟壞死病毒IPNV、病毒性出血敗血癥病毒VHSV、傳染性 鮭魚貧血癥病毒ISAV的探針，所述探針的序列分別為SEQ ID NO:37-46 ;
[0010] 作為優(yōu)選，上述的基因芯片上還設(shè)置有表面化學(xué)質(zhì)控（QC-I)和空白對照質(zhì)控 (QC-4);
[0011] 表面化學(xué)質(zhì)控（QC-I)為一段熒光素標(biāo)記的優(yōu)選的寡核苷酸序列，其序列為SEQ ID NO:47 C -ACA AGG GAT ATC GCT GGG T-3')，該序列不產(chǎn)生穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，與上述魚 類病毒病原的基因序列也沒有同源性；
[0012] 空白對照質(zhì)控（QC-4)為CldH2O。
[0013] 本發(fā)明所述的多重PCR和基因芯片用于非疾病診斷治療目的病毒檢測，所述病毒 為淋巴囊腫病毒IXDV、細(xì)胞腫大病毒屬虹彩病毒Mega、赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒RGNNVJf 染性造血器官壞死病毒IHNV、傳染性膜臟壞死病毒IPNV、病毒性出血敗血癥病毒VHSV、傳 染性鮭魚貧血癥病毒ISAV。
[0014] 本發(fā)明還提供一種使用上述多重PCR和基因芯片檢測淋巴囊腫病毒IXDV、細(xì)胞腫 大病毒屬虹彩病毒Mega、赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒RGNNV、傳染性造血器官壞死病毒IHNV、 傳染性胰臟壞死病毒IPNV、病毒性出血敗血癥病毒VHSV、傳染性鮭魚貧血癥病毒ISAV核酸 是否存在的方法，檢測不以疾病診斷治療為目的；所述方法包括如下的步驟：
[0015] 1)提取待檢測樣品的DNA和RNA ;
[0016] 2)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA ;
[0017] 3)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物標(biāo)記；
[0018] 首先進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增：在PCR擴(kuò)增液中添加引物組、提取的DNA和制備的cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0019] 其中PCR擴(kuò)增液中，在50 μ L反應(yīng)體系中含有0. 05U/ μ L的Taq酶、Mg2+濃度為 2mmol/L 的 10XPCR Buffer，0. 25mmol/L 的 dNTPs，0. 36ymol/L 的引物組各引物的混合 物；
[0020] 第一步？0?擴(kuò)增的反應(yīng)程序如下：94￡€511^11;94°(：158,56°(：158,72°(：158，15個(gè) 循環(huán)；94°(：158,70°(：158,6個(gè)循環(huán)；721€31^11;4°(：保存?zhèn)溆?；
[0021] 將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行過濾，取洗脫液作為第二步PCR擴(kuò)增的模板。
[0022] 第二步PCR擴(kuò)增體系：在單個(gè)200 μ1的PCR反應(yīng)管中，含2. 5U/μ L Taq DNA聚 合酶0.6 4 1^，10\卩0?811打6『(]\%2>1118)5 4 1^2.5臟〇1/1(1犯138 5 4 1^1(^111〇1/1正向通用 引物（Fs) 1 μ L，40 μ mol/L Cy3標(biāo)記的反向通用引物（Rs) 1 μ L，模板（上述洗脫液）10 μ L， ddH20 至 50 μ L。
[0023] 其中所使用的正向通用引物Fs的序列為SEQ ID NO: 48 (5' -CAG GCC ACG TTT TGT CAT GC-3')、反向通用引物 Rs 的序列為 SEQ ID N0:49(5' -TTC TTT GCG TTA TGT CTC TG-3r )；
[0024] 其中反向通用引物的5'端用熒光素標(biāo)記，作為實(shí)施例的優(yōu)選，所述的熒光素標(biāo)記 為Cy3標(biāo)記；
[0025] 第二步？0?擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94￡€511^11;941€3〇8,55 1€3〇8,721€3〇8,30個(gè)循環(huán)；72°C 3min ;4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 4)將Cy3標(biāo)記的第二步擴(kuò)增產(chǎn)物配制成雜交液，與預(yù)先制作好的基因芯片雜交； 雜交結(jié)束后清洗，在基因芯片掃描儀上采集熒光信號，判斷檢測結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：表 面化學(xué)質(zhì)控（QC-I)有清晰的熒光信號，同時(shí)空白對照質(zhì)控（QC-4)無熒光信號表示雜交結(jié) 果有效，此時(shí)各病毒探針位點(diǎn)有熒光信號即為病毒陽性，否則為病毒陰性；表面化學(xué)質(zhì)控 (QC-I)無熒光信號，或者空白對照質(zhì)控（QC-4)有熒光信號，表示雜交結(jié)果無效。
[0027] 常規(guī)多重P