用于環(huán)狀rna表達(dá)的dna序列和表達(dá)載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于環(huán)狀RNA表達(dá)的DNA序列和相應(yīng)的 表達(dá)載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)狀RNA (ciucular RNA，circRNA)是區(qū)別于傳統(tǒng)線(xiàn)性RNA的RNA家族新成員， 不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子。
[0003] 研究表明環(huán)狀RNA主要通過(guò)非典型可變剪切加工產(chǎn)生，廣泛存在于各種生物細(xì)胞 中，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以被RNA酶降解、表達(dá)豐度高、物種間保守性好，表達(dá)具有組織及時(shí)空 特異性等特征。已有研究顯示環(huán)狀RNA跟神經(jīng)發(fā)育、動(dòng)脈粥樣硬化、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、癌 癥等疾病相關(guān)。此外，最新研究在在人唾液和血液中檢測(cè)到環(huán)狀RNA的存在，提示環(huán)狀RNA 可以在血液，尿液，腹水等臨床標(biāo)本中穩(wěn)定存在，這些特點(diǎn)使得環(huán)狀RNA在新型疾病診斷與 治療方法的開(kāi)發(fā)應(yīng)用上具有廣闊的前景。
[0004] 但是目前對(duì)circRNA的功能及其調(diào)控機(jī)制知之甚少。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可以作 為"sponge"海綿吸附miRNA，阻斷miRNA對(duì)其革El基因的抑制作用；circRNA可以通過(guò)堿基 互補(bǔ)配對(duì)直接調(diào)控其他RNA水平；此外，circRNA還可能具有與蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)控蛋白的活 性等功能。
[0005] 要研究circRNA的功能和調(diào)控機(jī)制一個(gè)必不可少的手段就是在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)感 興趣的circRNA，觀察其對(duì)細(xì)胞功能的影響。那么，要提高circRNA在細(xì)胞中的表達(dá)效率進(jìn) 而研究其功能和調(diào)控機(jī)制，需要高效、穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)基因研究的工具。
[0006] 目前文獻(xiàn)報(bào)道circRNA過(guò)表達(dá)一般采取常見(jiàn)的商業(yè)化過(guò)表達(dá)載體如PCDNA3. 1等， 但是按照常方法將circRNA序列插入到載體中表達(dá)出來(lái)的是相應(yīng)的線(xiàn)性mRNA，無(wú)法有效表 達(dá)出circRNA。需要采取特殊的策略，以基因組DNA為模板，擴(kuò)增circRNA序列及其上游 1000 bp和下游200bp的序列，然后將上游SOObp序列通過(guò)反向互補(bǔ)插入到下游，這樣得到的 序列才能表達(dá)circRNA。2014年Liang對(duì)一個(gè)表達(dá)豐度極高的circRNA(hsa_circ_0001727) 的兩側(cè)內(nèi)含子序列進(jìn)行研究，并構(gòu)建了一個(gè)circRNA表達(dá)載體，但是該載體有局限性，僅個(gè) 別circRNA用該載體能表達(dá)成功，成功率低[20]?，F(xiàn)有方法操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)難度大，實(shí)驗(yàn)周 期長(zhǎng)，成功率低，給廣大學(xué)者研究circRNA帶來(lái)了極大的不變，限制了 circRNA分子作為新 型標(biāo)志物及疾病治療靶標(biāo)的研究和開(kāi)發(fā)。
[0007] 因此有必要從CircRNA的形成機(jī)制及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)出發(fā)，開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單易行，穩(wěn)定 高效的circRNA過(guò)表達(dá)DNA模序及相應(yīng)的載體。
[0008] circRNA是通過(guò)RNA可變剪接產(chǎn)生的。真核生物基因的剪接為GT-AG法則，即 前體RNA中參與內(nèi)含子剪接的兩個(gè)特殊位點(diǎn)，即在內(nèi)含子和外顯子交界處有兩個(gè)相當(dāng)短 的保守序列：5'端為GT，3'端為AG，成為GT-AG法則。典型的剪接位置一致順序組成為： 5' -AG-GUAAGu--------------YNYURAY--Y10-20-YAG_G-3'。其中 Y 為 U 或 C，N 為任何核 苷酸，箭頭所指為外顯子與內(nèi)含子的交界。5'端剪接位稱(chēng)供體位（donor site)，3'端剪接 位稱(chēng)受體位（acceptor site)。內(nèi)含子中還有另一段識(shí)別剪接邊界必不可少的序列稱(chēng)為分 枝點(diǎn)，位于3 端剪接位的上游，具有特征性組成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶（U或C)，R表示 嘌呤(A或G)，A是剪接時(shí)參與形成分枝的特別位點(diǎn)。緊接在分枝點(diǎn)的下游有一段多嘧啶序 列，也是參與剪接事件蛋白接合的位置。GT-AG保守剪接供體和受體的存在有利于提高可變 剪接發(fā)生效率，大大提高RNA環(huán)化概率。
[0009] Jeck et al等2013年在人Hs68細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)25000個(gè)環(huán)狀RNA，經(jīng)生物信 息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，circRNA的一個(gè)顯著特點(diǎn)是兩側(cè)的內(nèi)含子序列較長(zhǎng)，是常規(guī)基因的3倍以 上，而這些長(zhǎng)的內(nèi)含子中富含反向重復(fù)序列，其中最典型的就是Alu重復(fù)序列。Alu重復(fù) 序列是人類(lèi)基因組中一族散布的、長(zhǎng)度大約為300 bp的中等重復(fù)序列（重復(fù)頻率10~ 1〇4)。分析circRNA上下游500bp序列，發(fā)現(xiàn)20%的circRNA上下游包含Alu反向重復(fù)序 列，含有ALU重復(fù)序列的circRNA表達(dá)水平是對(duì)照的6倍以上，因此反向重復(fù)序列有助于提 高circRNA的表達(dá)水平。
[0010] 文獻(xiàn)報(bào)道的CircRNA過(guò)表達(dá)方法需要擴(kuò)增circRNA本身序列及其上下游序列，并 將上游序列反向互補(bǔ)插入到下游，構(gòu)建方法操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)難度大，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，給廣大學(xué) 者研究circRNA帶來(lái)了極大的不變。
[0011] 2014年Liang對(duì)一個(gè)表達(dá)豐度極高的circRNA (hsa_circ_0001727)的兩側(cè)內(nèi)含 子序列進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其上下游各有50bp左右的序列對(duì)circRNA的產(chǎn)生至關(guān)重要，由 此構(gòu)建了一個(gè)circRNA表達(dá)載體，但是該載體有局限性，部分circRNA用該載體能表達(dá)成 功，部分則不能，成功率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是在于提供一種適用于circRNA表達(dá)的DNA序列及其載體，該序列 普遍適用于各種circRNA的表達(dá)，表達(dá)效率高效、穩(wěn)定；該序列內(nèi)部包含多個(gè)酶切位點(diǎn)，滿(mǎn) 足絕大多數(shù)circRNA的表達(dá)需求；且該序列能整合到各種類(lèi)型的表達(dá)載體，能應(yīng)用于普通 真核表達(dá)、慢病毒表達(dá)、腺病毒表達(dá)、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)、原核表達(dá)等各種表達(dá)體系中；應(yīng)用含 有該序列的載體表達(dá)circRNA操作簡(jiǎn)單易行，易于推廣。
[0013] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 一種用于環(huán)狀RNA表達(dá)DNA序列，其特征在于，核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 序列中的：" CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCCG " 為上下游反 向重復(fù)序列，CACTACTAACTTTCTTCTTTCCTTTCCCAG 以及 AGGTAAGTAACAACTCTGTG 為剪接供體 和受體序列，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN為多克隆位點(diǎn)區(qū)域，N表示任意核 酸，序列可以根據(jù)需要擬定。
[0015] 含有上述用于環(huán)狀RNA表達(dá)DNA序列的載體，插入到真核表達(dá)載體或慢病毒載體 或腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，形成系列circRNA專(zhuān)用表達(dá)載體。
[0016] circRNA專(zhuān)用表達(dá)載體如pcDNA-circRNA載體，核苷酸序列為SEQ ID NO: 2所示； pcDNA-circRNA載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域序列為： GGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCTCGAGTCTAGA，引物依次是 ΚρηΙ、 BamHI、EcoRI、EcoRV、XhoI 和 XbaI。
[0017] circRNA專(zhuān)用表達(dá)載體為pLL-circRNA載體，核苷酸序列為SEQ ID NO: 3所示， pLL-circRNA載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域序列為： GCTAGCTTAATTAAGGATCCACTAGTGGAATTCTACCGGTGCAGATATCCAGCTCGAG，引物依次是 Nhe I、Pac I、BamHI、EcoRI、Age I、EcoRV 和 Xho I 〇
[0018] 本發(fā)明具體的載體的構(gòu)建方案如下： 1. circRNA過(guò)表達(dá)DNA模序設(shè)計(jì)： 根據(jù)circRNA的形成機(jī)制和真核生物RNA剪接的GT-AG法則，設(shè)計(jì)出適用于circRNA 表達(dá)剪接供體和剪接受體序列；根據(jù)circRNA兩次內(nèi)含子序列富含反向重復(fù)序列和真核生 物基因組中普遍存在ALU重復(fù)序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)circRNA表達(dá)普遍適用的上下游反向重復(fù) 序列；根據(jù)商業(yè)化載體pcDNA3. 1和pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-Puro的序列信息，設(shè)計(jì)合適的 多克隆位點(diǎn)，從而得到完整的實(shí)驗(yàn)circRNA過(guò)表達(dá)的DNA序列。并將這2個(gè)DNA序列交給 核酸合成公司進(jìn)行全基因合成. 2. 構(gòu)建circRNA專(zhuān)用的表達(dá)載體： 將合成的DNA序列2通過(guò)NheI和ApaI位點(diǎn)構(gòu)建入pcDNA3. 1載體中，得到 pcDNA-circRNA質(zhì)粒，測(cè)序確認(rèn)質(zhì)粒正確；將合成的DNA序列2通過(guò)XbaI和NotI位點(diǎn)構(gòu)建 入pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-Puro載體中，得到pLL-circRNA質(zhì)粒，測(cè)序確認(rèn)質(zhì)粒正確。
[0019] 3.構(gòu)建多個(gè)circRNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒： 從 CircBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載 hsa_circ_0001730、hsa_circ_0000268、hsa_ circ_0001727、hsa_circ_0001756、hsa_ci;rc_0000284、hsa_ci;rc_0000711 等 circRNA 的序 列信息，設(shè)計(jì)引物從人cDNA文庫(kù)中調(diào)取這些circRNA的序列；將序列通過(guò)KpnI和XbaI位 點(diǎn)插入到上述構(gòu)建好的pcDNA-circRNA質(zhì)粒中，測(cè)序確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建正確。
[0020] 4.驗(yàn)證pcDNA-circRNA質(zhì)粒的過(guò)表達(dá)效果： 將系列circRNA表達(dá)質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞樣本；提取RNA， 逆轉(zhuǎn)錄后QPCR觀察這些表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)效果。
[0021] 5.構(gòu)建pLL-circRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒： 從CircBase數(shù)據(jù)庫(kù)中下載hsa_circ_0001730 circRNA的序列信息，設(shè)計(jì)引物從人 cDNA文庫(kù)中調(diào)取這個(gè)circRNA的序列；將序列通過(guò)NheI和XhoI位點(diǎn)插入到上述構(gòu)建好的 pLL-circRNA慢病毒質(zhì)粒中，測(cè)序確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建正確。
[0022] 6.驗(yàn)證pLL-circRNA慢病毒系統(tǒng)的過(guò)表達(dá)效果： pLL-circRNA質(zhì)粒與PMDG、PMSV、PMOII質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，48h和 72h后收集并純化慢病毒；慢病毒感染H印G2, SMMC7721并用Puromycin進(jìn)行篩選構(gòu)建穩(wěn)定 表達(dá)細(xì)胞株，收集細(xì)胞，提取RNA逆轉(zhuǎn)錄后QPCR檢測(cè)hsa_circ_0001730的表達(dá)效果。
[0023] 該序列以及載體能整合到各種類(lèi)型的表達(dá)載體，能應(yīng)用于普通真核表達(dá)、慢病毒 表達(dá)、腺病毒表達(dá)、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)、原核表達(dá)等各種表達(dá)體系中。
[0024] 本申請(qǐng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)計(jì)了多種DNA序列，經(jīng)過(guò)可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本發(fā)明涉 及的DNA序列及其相應(yīng)的表達(dá)載體效果最佳，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定、表達(dá)高效（circRNA表 達(dá)水平提高百倍以上)。該序列及相應(yīng)的載體能廣泛應(yīng)用于各種circRNA的表達(dá)，為研究 circRNA的功能和機(jī)制提供了一個(gè)有力的研究工具，為進(jìn)一步確定circRNA分子作為新型 標(biāo)志物及疾病治療靶標(biāo)的研究和開(kāi)發(fā)提供理論支持。