步驟103、，以所述小麥赤霉病高感品種和小麥赤霉病高抗品種DNA為模板，分別 使用201對SSR引物對其進行PCR擴增；
[0068] 201對SSR引物通過參考已經(jīng)對小麥赤霉病抗性進行SSR分子標記的相關(guān)報道及 應(yīng)用引物設(shè)計軟件PrimerPremier5. 0結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫信息設(shè)計。
[0069] PCR 反應(yīng)體系為 25ul，其中 10Xbuffer2. 5ul，25mMMg2+l. 5ul，2. 5mMdNTPsO. 2ul， 正向引物和反向引物各Iul，Taq酶（5U/ul) 0. 2ul，模板DNA2. 5ul，補水至25ul ;
[0070] PCR擴增參數(shù)為94°C預(yù)變性5min后，94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸 lmin，循環(huán)34次，最后72°C延伸8min，4°C下保存；在Biometra公司的Tl型PCR擴增儀上 進行PCR擴增。
[0071 ] 步驟104、PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分析
[0072] PCR擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，電泳完成后，凝膠用 0. 2%硝酸銀溶液浸泡震蕩IOmin后用蒸餾水洗滌2次，然后在紫外透射儀上照相，篩選出 具有多態(tài)性的28對SSR引物。如圖1、圖2所示，圖1為引物P138PCR擴增后的電泳圖，標 號為1、2、3分別代表高抗品種B1、B3、B5為模板的PCR擴增結(jié)果，標號為4、5、6分別代表高 感品種C1、C5、C6為模板的PCR擴增結(jié)果，從圖中可以看到，以高抗品種B1、B3、B5為模板， 有擴增出產(chǎn)物，而以高感品種CU C5、C6為模板，沒有擴增出與高抗品種擴增產(chǎn)物相同分子 量的產(chǎn)物，說明引物P138具有多態(tài)性，28對引物中其他27對引物結(jié)果與圖1相同。圖2是 引物P187PCR擴增后的電泳圖，標號為1、2、3分別代表高抗品種B1、B3、B5為模板的PCR擴 增結(jié)果，標號為4、5、6分別代表高感品種CU C5、C6為模板的PCR擴增結(jié)果，從圖中可以看 到，不論以高抗品種BI、B3、B5為模板，還是以高感品種Cl、C5、C6為模板，均有擴增出相同 分子量的產(chǎn)物，說明引物P187不具有多態(tài)性。
[0073] 篩選出的具有多態(tài)性的28對SSR引物如表二所示：
[0074] 表2有多態(tài)性的28對SSR引物序列表 CN 105176985 A I兄明書 6/9 頁
CN 105176985 A 說明書 7/9 頁
CN 105176985 A 說明書 8/9 頁
[0078] 步驟105、以篩選出的28對SSR引物，以普通小麥和小麥赤霉病高抗品種RIL株系 DNA為模板進行PCR擴增；
[0079] 黑麥/豫麥2號雜交構(gòu)建RIL株系，有多態(tài)性的28對SSR引物對133個RIL株系 DNA進行復(fù)篩。
[0080] PCR 反應(yīng)體系為 25ul，其中 10Xbuffer2. 5ul，25mMMg2+l. 5ul，2. 5mMdNTPsO. 2ul， 正向引物和反向引物各Iul，Taq酶（5U/ul) 0. 2ul，模板DNA2. 5ul，補水至25ul ;
[0081] PCR擴增參數(shù)為94°C預(yù)變性5min后，94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸 lmin，循環(huán)34次，最后72°C延伸8min，4°C下保存；在Biometra公司的Tl型PCR擴增儀上 進行PCR擴增。
[0082] 步驟106、PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分析；
[0083] PCR擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，電泳完成后凝膠用 0. 2%硝酸銀溶液浸泡震蕩IOmin后用蒸餾水洗滌2次，然后在紫外透射儀上照相。根據(jù)電 泳結(jié)果，參照小麥赤霉病高抗品種和普通小麥的擴增結(jié)果，篩選出RIL株系的擴增結(jié)果呈 現(xiàn)多態(tài)性的SSR分子標記引物，共有7對引物，分別是Xssrpl9、Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、 Xssrpl38、Xssrpl57及Xssrp201，如圖3和圖4所示，圖中1為高抗（母本），2為高感（父 本），3~13為隨機RIL系，篩選的7對SSR引物如表三所示：
[0084] 表3用于分子鏈鎖作圖的7對SSR引物序列表
CN 105176985 A 說明書 9/9 頁
[0087] 步驟107、應(yīng)用Joinmap4. 0軟件構(gòu)建遺傳圖譜。
[0088] 上述7個引物，其中有4個分別初步整合到已發(fā)表的3BS上的分子遺傳圖譜，3個 初步整合到7A上，如圖5和圖6所示。
[0089] 利用 Zhouetal 和 Shenetal 發(fā)表的定位于 3BS 上的 SSR 標記 Xgwm389、Xgwm493、 Xgwm533、XBarcl47、XBarcl31、XBarc238、XBarc217. 3、XCS-SSR7、XCS-SSR20 在群體中進 行基因分型，建立3BS赤霉病抗性QTL區(qū)域以SSR標記為基礎(chǔ)的初級連鎖圖。本發(fā)明在 3BS上增加了 4個SSR標記，分別命名為Xssrp91、Xssrp97、Xssrp201和Xssrpl57。如圖 5 所示，Xssrp201 位于 Xbrcl31 外側(cè) 2. 6cM 處，Xssrp91 位于 Xbrcl31 外側(cè) 2. 6cM 處 5. 7cM 處，Xssrp97 位于 Xssrp91 和 XCS-SSR7 之間距離 XCS-SSR73. OcM，Xssrpl57 在 Xgwm493 和 Xbarcl47之間靠近Xgwm4930. 7cM的位置。
[0090] Nicholson(2000)利用抗赤霉病品種Tritieummaeha為染色體供體的單體系列， 定位了 B1、4A和7A染色體與抗赤基因有關(guān)。本發(fā)明在7A染色體上增加了 3個SSR標記分 別命名為 Xssrpl9、Xssrp81、Xssrpl38。如圖 6 所不，Xssrp81 在 Xwmcl68_7A 外側(cè) 0· 2cM 處，Xssrpl38 在 Xwmc479 內(nèi)側(cè) 0· 2cM 處，Xssrpl9 在 Xssrpl38 和 Xwmc479_7A 之間距離 Xwmc479_7A0. 6Cm〇
[0091] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種遠緣雜交小麥的SSR分子標記引物，其特征在于，所述引物包括XSSrpl9、 Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrpl38、Xssrpl57 及Xssrp201，各引物所對應(yīng)的序列為： Xssrpl9 :正向ACATCATCAACTATGCCGAACA 反向 CGCCTTTAGATCCCACCC Xssrp81 :正向CGAGGGTCAAACGCAAAG 反向 ATCTCCGACGACGAGGGTG Xssrp91 :正向 CTACTTTGCCGTGTTCTTCTC 反向 GCCGTGGACTTCCAITTCT Xssrp97 :正向CTGAAAGGAGCAACATAT 反向 TAAACAACCAAGGAAGAA Xssrp138 :正向GGAGCGGAATGGATAAATAA 反向 GGAAGGAAACGCAGGAGA Xssrpl57 :正向 GTCGTGCTTGCGTTAGAT 反向 GACTTGGAATGGAGGITG Xssrp201 :正向 TTGCCACGAAGTGATTGC 反向 ITGGATGATGCCCTGACC。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的SSR分子標記引物，其特征在于，所述引物的退火溫度分別 為： Xssrpl9 ：55〇C Xssrp81 ：60°C Xssrp91 ：50°C Xssrp97 ：55〇C Xssrpl38 ：50°C Xssrpl57 ：55〇C Xssrp201 :55°C。3. 根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的SSR分子標記引物，其特征在于，小麥的遠緣品種是小黑 麥。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的SSR分子標記引物，其特征在于，Xssrp19、Xssrp81、Xssrp138 位于染色體7A上，Xssrp91、Xssrp97、Xssrpl57和Xssrpl38位于染色體3BS上。5. 權(quán)利要求1所述的SSR分子標記引物的篩選方法，其特征在于，包括： A、 從小麥遠緣物種中確定赤霉病高感品種和赤霉病高抗品種； B、 通過小麥赤霉病高感品種和小麥赤霉病高抗品種對201對SSR分子標記引物進行多 態(tài)性初步篩選； C、 通過小麥赤霉病高抗品種、普通小麥以及上述高抗品種與普通小麥的RIL株系對初 步篩選出的SSR分子標記引物進行多態(tài)性復(fù)篩，對復(fù)篩出的SSR分子標記引物進行分子連 鎖圖譜構(gòu)建。6. 權(quán)利要求5所述的SSR分子標記引物的篩選方法，其特征在于，所述步驟A包括： (1)小麥開花時，采用單花滴注法進行赤霉病接種鑒定，接種后21d，調(diào)查接種穗的病小穗 數(shù)；用EXCEL計算每個品種的病情指數(shù)；參照江蘇省農(nóng)科院制定的單花滴注接種等級劃分 標準進行等級劃分；（2)同時對小麥進行室內(nèi)毒素鑒定，使用赤霉菌粗毒素處理小麥幼苗 并計算根長抑制率、芽長抑制率和細胞損傷度，檢測不同品種小麥對于赤霉菌粗毒素的抗 性；（3)根據(jù)間單花滴注赤霉病抗性鑒定和室內(nèi)毒素鑒定結(jié)果進行系統(tǒng)比較和相關(guān)性統(tǒng)計 分析，確定赤霉病高抗品種和赤霉病高感品種； 所述步驟B包括：提取赤霉病高抗品種和赤霉病高感品種各品種小麥的DNA;分別用 201對SSR分子標記引物對上述各品種小麥的DNA進行PCR擴增，然后進行電泳分析，初步 篩選出具有多態(tài)性的SSR分子標記引物； 所述步驟C包括：提取小麥赤霉病高抗品種、普通小麥以及上述高抗品種與普通小麥 的RIL株系各品種小麥的DNA;分別用步驟B篩查出的SSR分子標記引物對上述各品種小 麥的DNA進行PCR擴增，然后進行電泳分析，復(fù)篩出具有多態(tài)性的SSR分子標記引物，應(yīng)用 Joinmap4. 0軟件構(gòu)建其分子連鎖圖譜。7. 權(quán)利要求6所述的SSR分子標記引物的篩選方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)體系 為：25ul，其中IOXbuffer2.5ul，25mMMg2+1.5ul，2.5mMdNTPs0.2ul，正向引物和反向引 物各Iul，Taq酶（5U/ul) 0. 2ul，模板DNA2. 5ul，補水至25ul;所述PCR擴增反應(yīng)參數(shù)為 94°C預(yù)變性5min后，94°C變性lmin，50~60 °C退火lmin，72 °C延伸Imin，循環(huán)34次，最后 72°C延伸8min，在4°C下保存；PCR擴增產(chǎn)物在8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離， 電泳完成后，凝膠用0. 2%硝酸銀溶液浸泡震蕩IOmin后用蒸餾水洗滌2次，然后在紫外透 射儀上照相。8. 權(quán)利要求7所述的SSR分子標記引物的篩選方法，其特征在于，所述的小麥遠緣物種 包括小黑麥、小偃麥和小賴麥。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的SSR分子標記引物的篩選方法，其特征在于，所述PCR擴增使 用儀器為在Biometra公司的Tl型PCR擴增儀。10. 權(quán)利要求1所述的SSR分子標記引物可用于鑒定遠緣雜交小麥赤霉病抗性的相關(guān) 基因。
【專利摘要】本發(fā)明提供遠緣雜交小麥的SSR分子標記引物及用途和篩選方法。所述引物包括Xssrp19、Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrp138、Xssrp157及Xssrp201，本發(fā)明提供的遠緣雜交小麥的SSR分子標記引物，針對遠緣雜交得到的小麥品種尋找赤霉病抗原。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105176985
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】黃進勇, 肖國靜, 陳曉兵, 劉彬, 張建波
【申請人】鄭州大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月28日