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      一種檢測甘薯羽狀斑駁病毒的rt-lamp試劑盒及其專用引物的制作方法_3

      文檔序號:8959467閱讀:來源:國知局
      1提取的SPFMV總RNA得到反 應液,然后將反應液于63°C反應60分鐘。反應結束后,觀察反應液的顏色變化。設置2個 EP管作為重復。
      [0076] 按照上述方法,將SPFMV總RNA分別替換為SPVC總RNA、SPVG總RNA、SPLCV總 RNA、SPSMV-I總RNA、SPV2總RNA和滅菌超純水,其它步驟均不變。反應結束后,觀察相應 反應液的顏色變化。
      [0077] (2)結果觀察和判定:如果反應液的目測顏色為綠色、則待測樣品中含有或疑似 含有甘薯羽狀斑駁病毒;如果反應液的目測顏色為橙色、則所述待測樣品中不含有或疑似 不含有甘薯羽狀斑駁病毒。
      [0078] 實驗結果見圖1中B(l、2為滅菌超純水,3、4為SPLCV,5、6為SPVC,7、8為SPVG, 9、10 為 SPSMV-I,11、12 為 SPFMV,13、14 為 SPV2)。只有加入 SPFMV 總 RNA 的 EP 管進行 RT-LAMP后,反應液為綠色。
      [0079] 上述結果表明,本發(fā)明提供的檢測甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒可特異的 檢測甘薯羽狀斑駁病毒。
      [0080] 實施例4、實施例2的檢測甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒的靈敏度
      [0081] -、以實施例2的檢測甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒C進行靈敏度實驗,實 驗重復三次,每次重復的步驟如下:
      [0082] 1、用 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司產(chǎn) 品)提取SPFMV總RNA,命名為RNAl。RNAl中RNA的濃度為Ing/ μ 1。
      [0083] 2、吸取Iml RNAl加入盛有9ml無菌超純水中的試管中充分混勻,得到RNA2 ;以此 類推制成RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、RNA7和RNA8。使用Beckman UV-800紫外分光光度計測定 稀釋后各個梯度的 RNA 濃度,分別為 IOOpg/μ 1、IOpg/μ 1、Ipg/μ IUOOfg/μ 1、IOfg/μ 1、 lfg/ μ 1 和 IOOag/ μ 1。
      [0084] 2、RT-LAMP
      [0085] (1)向試管中加入24 μ 1反應試劑C和1 μ 1步驟1制備的RNAl得到反應液,然后 將反應液于63°C反應60分鐘。以循環(huán)數(shù)為橫坐標,PCR產(chǎn)物的量為縱坐標,得到熒光檢測 系統(tǒng)繪制的擴增曲線。設置2個試管作為重復。
      [0086] 按照上述方法,將RNAl分別替換為步驟1制備的RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、 RNA7、RNA8和滅菌超純水,其它步驟均不變,得到相應的擴增曲線。
      [0087] (2)結果觀察和判定:如果擴增曲線呈現(xiàn)典型的"S型"、則待測樣品中含有或疑似 含有甘薯羽狀斑駁病毒;如果擴增曲線呈現(xiàn)為水平直線、則所述待測樣品不含有或疑似不 含有甘薯羽狀斑駁病毒。
      [0088] RT-LAMP 結果表明,向反應試劑中加入 RNAl、RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6 或 RNA7 進行RT-LAMP均得到典型的"S型"擴增曲線,而向反應試劑中加入RNA8或滅菌超純水進 行RT-LAMP得到的擴增曲線均為水平的直線。表明,本發(fā)明提供的檢測甘薯羽狀斑駁病毒 的RT-LAMP試劑盒對甘薯羽狀斑駁病毒RNA的最小檢測限為25fg。
      [0089] 二、以實施例2的檢測甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒D進行靈敏度實驗,實 驗重復三次,每次重復的步驟如下:
      [0090] 1、用 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司產(chǎn) 品)分別提取SPFMV總RNA,命名為RNA1。RNAl中RNA的濃度為Ing/ μ 1。
      [0091] 2、吸取Iml RNAl加入盛有9ml無菌超純水中的試管中充分混勻,得到RNA2 ;以此 類推制成RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、RNA7和RNA8。使用Beckman UV-800紫外分光光度計測定 稀釋后各個梯度的 RNA 濃度,分別為 IOOpg/μ 1、IOpg/μ 1、Ipg/μ IUOOfg/μ 1、IOfg/μ 1、 lfg/ μ 1 和 IOOag/ μ 1。
      [0092] 2、RT-LAMP
      [0093] (1)向EP管中加入24 μ 1反應試劑D和1 μ 1步驟1制備的RNAl得到反應液,然 后將反應液于63°C反應60分鐘。反應結束后,觀察反應液的顏色變化。設置2個EP管作 為重復。
      [0094] 按照上述方法,將RNAl分別替換為步驟1制備的RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、 RNA7、RNA8和滅菌超純水,其它步驟均不變,其它步驟均不變。反應結束后,觀察相應反應 液的顏色變化。
      [0095] (2)結果觀察和判定:如果反應液的目測顏色為綠色、則待測樣品中含有或疑似 含有甘薯羽狀斑駁病毒;如果反應液的目測顏色為橙色、則所述待測樣品中不含有或疑似 不含有甘薯羽狀斑駁病毒。
      [0096] 實驗結果見圖2 (1、2為滅菌超純水,3、4為RNAl,5、6為RNA2,7、8為RNA3,9、10為 RNA4,11、12 為 RNA5,13、14 為 RNA6,15、16 為 RNA7,17、18 為 RNA8)。只有加入 RNA8 或滅菌 超純水的EP管進行RT-LAMP后,反應液為綠色。結果表明,本發(fā)明提供的檢測甘薯羽狀斑 駁病毒的RT-LAMP試劑盒對甘薯羽狀斑駁病毒RNA的最小檢測限為25fg。
      【主權項】
      1. 一種成套引物,由引物SPFMV-F3、引物SPFMV-B3、引物SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、 引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB組成,各條引物均為單鏈DNA分子,核苷酸序列依次為序列 表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。2. 如權利要求1所述成套引物,其特征在于:所述成套引物中,所述引物SPFMV-F3、所 述引物SPFMV-B3、所述引物SPFMV-FIP、所述引物SPFMV-BIP、所述引物SPFMV-LF和所述引 物SPFMV-LB的摩爾比為 1:1:8:8:4:4。3. 如權利要求2所述成套引物,其特征在于:所述成套引物中,各引物的量如 下:0? 2ymol所述引物SPFMV-F3、0. 2ymol所述引物SPFMV-B3、1. 6ymol所述引物 SPFMV-FIP、L6ymol所述引物SPFMV-BIP、0. 8ymol所述引物SPFMV-LF、0. 8ymol所述引 物SPFMV-LB。 4?權利要求1所述成套引物的制備方法,為如下(I)、(II)或(III): (I)所述成套引物中各條引物分別單獨包裝; (II)所述成套引物中各條引物按照權利要求2所述比例混合在一起; (III)所述成套引物中各條引物按照權利要求3所述量混合在一起。5. 權利要求1至3中任一所述成套引物的應用,為如下a)或b)或c)或d): a) 制備用于檢測或輔助檢測甘薯羽狀斑駁病毒的試劑盒; b) 檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或疑似含有甘薯羽狀斑駁病毒; c) 制備用于鑒定或輔助鑒定甘薯羽狀斑駁病毒的試劑盒; d) 鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的甘薯羽狀斑駁病毒。6. 含有權利要求1至3中任一所述成套引物的試劑盒。7. 權利要求6所述試劑盒的應用,為如下e)或f): e) 檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或疑似含有甘薯羽狀斑駁病毒; f) 鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的甘薯羽狀斑駁病毒。8. -種檢測待測樣品是否含有甘薯羽狀斑駁病毒的方法,包括如下步驟: 提取待測樣品的總RNA,以權利要求1-3中任一所述成套引物進行逆轉錄環(huán)介導等溫 擴增,然后進行如下評判:如果所述成套引物可以實現(xiàn)對所述總RNA的逆轉錄環(huán)介導等溫 擴增,則待測樣品中含有或疑似含有甘薯羽狀斑駁病毒;如果所述成套引物不能實現(xiàn)對所 述總RNA的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增,則所述待測樣品不含有或疑似不含有甘薯羽狀斑駁病 毒。9. 如權利要求5或7所述的應用,或,權利要求8所述的方法,其特征在于:所述待測 樣品為植物樣品或微生物樣品。10. -種鑒定待測病毒是否為候選的甘薯羽狀斑駁病毒的方法,包括如下步驟: 提取待測病毒的總RNA,以權利要求1-3中任一所述成套引物進行逆轉錄環(huán)介導等溫 擴增,然后進行如下評判:如果所述成套引物可以實現(xiàn)對所述總RNA的逆轉錄環(huán)介導等溫 擴增,則待測病毒為候選的甘薯羽狀斑駁病毒;如果所述成套引物不能實現(xiàn)對所述總RNA 的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增,則所述待測病毒為候選的非甘薯羽狀斑駁病毒。
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒及其專用引物。本發(fā)明所提供的檢測甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒的專用引物由引物SPFMV-F3、引物SPFMV-B3、引物SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB組成,核苷酸序列依次為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。實驗證明,本發(fā)明提供的一種檢測甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒及其專用引物能特異性地檢測甘薯羽狀斑駁病毒,與其他病毒無交叉反應,對甘薯羽狀斑駁病毒的RNA的最小檢測限為25fg。
      【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/70
      【公開號】CN105176986
      【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】董杰, 喬巖, 王品舒, 李永強, 岳瑾, 楊建國, 王偉青, 張金良, 袁志強
      【申請人】北京市植物保護站
      【公開日】2015年12月23日
      【申請日】2015年10月12日
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