檢測(cè)STMN1 mRNA表達(dá)量的引物、Taqman探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)STMNl mRNA表達(dá)量的引物、Taqman 探針和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 微管不穩(wěn)定蛋白（STMNl)是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)可溶性磷酸蛋白質(zhì)，在細(xì)胞周 期的不同階段通過磷酸化和去磷酸化作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞微管系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)平衡，控制細(xì)胞周 期，改變細(xì)胞的增殖、分化等生物學(xué)行為。其對(duì)于微管的調(diào)節(jié)作用是有絲分裂中紡錘體形成 的重要保障，因而也成為了抗微管類藥物的直接靶點(diǎn)。
[0003] 抗微管類藥物是通過作用于細(xì)胞微管而影響紡錘體形成，并抑制細(xì)胞有絲分裂的 一類廣譜化療藥。臨床上被廣泛應(yīng)用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌、頭頸部腫瘤、膀胱癌、食 管癌等。目前常用的抗微管類藥物主要為紫杉烷類和長(zhǎng)春堿類，紫杉烷類包括紫杉醇、多西 他賽，主要通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的微管聚合以及穩(wěn)定已聚合的微管，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量微管 聚集，進(jìn)而干擾細(xì)胞各種功能，特別是使細(xì)胞停止分裂；長(zhǎng)春堿類包括長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春新堿和 長(zhǎng)春瑞濱等，它們可以抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的聚合、抑制紡錘體微管的形成，使核分裂 停滯于細(xì)胞分裂中期，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。STMNl通過促進(jìn)微管的解聚或阻止微管的聚 合從而影響有絲分裂紡錘體的形成，影響細(xì)胞的正常分裂。STMNl蛋白的表達(dá)情況直接影響 到抗微管藥物的化療活性，因而對(duì)于STMNl的檢測(cè)有利于臨床醫(yī)生對(duì)于病人的個(gè)體化用藥 選擇。
[0004] 從檢測(cè)角度上來說，對(duì)于mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)主要有Nothern blot雜交、原位雜 交、RT-PCR以及近幾年興起的液相芯片法。Nothern blot和原位雜交由于操作復(fù)雜，對(duì)于 操作人員的技術(shù)要求較高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等原因?qū)е缕鋺?yīng)用受到限制；液相芯片法檢測(cè)靈敏 度高，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)，但是由于液相芯片法成本高，對(duì)于檢測(cè)設(shè)備要求也高，因而推 廣受到限制；而RT-PCR由于操作相對(duì)簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)設(shè)備在大多數(shù)醫(yī)院都可以得 到滿足，因而在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。
[0005] RT-PCR主要包括半定量PCR和定量PCR兩種，而定量PCR又包含相對(duì)定量PCR和 絕對(duì)定量PCR。絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)；相對(duì)定量方法則是比較經(jīng) 過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異。所謂相對(duì)定量是指在測(cè)定 目的基因的同時(shí)測(cè)定某一內(nèi)源性基因，該基因的作用有：（1)用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較； ⑵作為內(nèi)源性對(duì)照補(bǔ)償待測(cè)樣本的體積變異、核酸抽提過程中造成的目的基因變異，以及 反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素；（3)標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)本。由于基因在各種組織中 是恒定表達(dá)的，所以可以以基因的定量來作為某種標(biāo)準(zhǔn)以比較樣本來源不同的目的基因表 達(dá)量的差異。通常選用的基因有GAPDH、f3-ACTIN、B2M和rRNA，研究者也可以根據(jù)具體的 需要而選定合適的基因。
[0006] 常用的相對(duì)定量可分為雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和△ AC t法。相對(duì)定量較為早期使用的方 法是用一系列已知外參物做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到目的基因和基因的量，再將目 的基因的同基因的比值作為定量的最后結(jié)果。這一方法要求外參、目的基因和基因的擴(kuò)增 效率一致。這種方法通量較低，但結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確。另一種是用AAC t方法進(jìn)行相對(duì)定 量?！?AC t方法使用單一的樣品（被稱為校正樣品）來比較未知樣品的目標(biāo)基因的表達(dá)。 校正樣品在每個(gè)板上與未知樣品同時(shí)分析。校正公式為：這里Δ AC t = [C (目的 基因）-C t待測(cè)樣本（基因）]-[C t校正樣本（目的基因）-C t校正樣本（基因）]。校正樣品是任何 被選做代表1倍目的基因表達(dá)量的樣品。這一公式基于這樣一種假設(shè)：目的基因的擴(kuò)增效 率與看家基因的擴(kuò)增效率相同，效率接近于1，并且目標(biāo)基因擴(kuò)增一倍其Ct值減少一個(gè)循 環(huán)。實(shí)際情況很少會(huì)與這一假設(shè)完全相符，然而，這種方法的優(yōu)越性在于，由于無需在每個(gè) 板上對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析使樣品的通量得以增加，并且這一方法更有益于檢測(cè)基因 表達(dá)的誘導(dǎo)或下調(diào)。
[0007] 在臨床上被廣泛應(yīng)用的是相對(duì)定量PCR，它可以準(zhǔn)確檢測(cè)出一個(gè)基因的相對(duì)表達(dá) 變化，從而為患者病情的診斷提供參考依據(jù)。相對(duì)定量PCR有兩種檢測(cè)方法，一種是SYBR green染料檢測(cè)法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)?入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而 保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步；另一種是Taqman探針法，當(dāng)探針完整時(shí)， 報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探 針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)， 即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完 全同步。SYBR green法操作簡(jiǎn)單，價(jià)格也比較便宜，靈敏度也相對(duì)較高，因而受到青睞，科學(xué) 研究中很多使用SYBR green法，但是由于SYBR green染料結(jié)合的是雙鏈DNA，不具有特異 性，因此也比較容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況；Taqman法具有靈敏度高，特異性好的特點(diǎn)，因而在 臨床上普遍采用這種方法，但是由于探針結(jié)合所需要的溫度較高，因此探針的片段長(zhǎng)度一 般也比較長(zhǎng)，不利于找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)，此外，探針長(zhǎng)度的增加也降低 了探針結(jié)合的效率，影響了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，常規(guī)Taqman探針法無法識(shí)別cDNA和 基因組的差別，無法避免在RNA提取過程中摻雜的基因組而導(dǎo)致產(chǎn)生假陽(yáng)性的情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)能力的不足，本發(fā)明在Taqman探針法的基礎(chǔ)上提供一種 具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度檢測(cè)STMNl mRNA表達(dá)量的引物和Taqman探 針。
[0009] 基于以上引物和探針，本發(fā)明還提供了一種操作方法簡(jiǎn)單的檢測(cè)STMNl mRNA表達(dá) 量的試劑盒，尤其適用于檢測(cè)患者腫瘤細(xì)胞中的STMNl mRNA表達(dá)量。
[0010] 本發(fā)明提供的檢測(cè)STMNl mRNA表達(dá)量的引物和Taqman探針，所述引物的核苷酸 序列如SEQ ID NO: 1~2所示，所述Taqman探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；探針 5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
[0011] 優(yōu)選地，Taqman探針為Taqman MGB探針。
[0012] 本發(fā)明引物設(shè)計(jì)的原理是在STMNl基因的2、3號(hào)外顯子上設(shè)計(jì)跨外顯子的上、下 游特異性引物。上游引物的5'端和3'端分別設(shè)計(jì)在2號(hào)外顯子和3號(hào)外顯子上，并且上 下游引物之間隔了一個(gè)長(zhǎng)達(dá)1000多bp的內(nèi)含子，以及高特異性的MGB探針，故只能識(shí)別經(jīng) 過剪切修飾的成熟的STMNl mRNA，而無法識(shí)別基因組中STMNl的序列，避免了在組織RNA提 取過程中混入少量基因組DNA而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。
[0013] 另外，本發(fā)明優(yōu)選采用Taqman-MGB探針，與普通的Taqman探針比較，MGB探針具 有兩大特點(diǎn)：一是探針3'端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA等 熒光標(biāo)記。這使熒光本底信號(hào)的干擾大大降低，熒光光譜分辨率得以大大改善。二是探針 3'端增加了一個(gè)MGB。MGB可以穩(wěn)定探針與模板的雜交，提高探針的退火溫度，一方面縮短 了探針長(zhǎng)度，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好；另一方面，也提高了探針 的特異性，使結(jié)果更精確，分辨率更高。
[0014] 本發(fā)明提供的檢測(cè)STMNl mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括以上所述的檢測(cè)STMNl mRNA 表達(dá)量的引物和Taqman探針。
[0015] 優(yōu)選地，試劑盒中還包括內(nèi)參基因 B2M的擴(kuò)增引物和Taqman-MGB探針，B2M的擴(kuò) 增引物核苷酸序列如SEQ ID N0:4~5所示，B2M的Taqman-MGB探針核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。所述內(nèi)參基因探針同樣為Taqman-MGB探針，探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)， 3'端標(biāo)記有非熒光性淬滅基團(tuán)。
[0016] 在進(jìn)行熒光定量PCR的時(shí)候，還需要使用適當(dāng)?shù)膬?nèi)參引物及相應(yīng)的熒光探針以便 進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明B2M較GAPDH和β -ACTIN是更加穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
[0017] 優(yōu)選地，試劑盒中還包括陰性對(duì)照品、STMNl標(biāo)準(zhǔn)品和Β2Μ標(biāo)準(zhǔn)品；其中，陰性 對(duì)照品為超純水，STMNl標(biāo)準(zhǔn)品為含有SEQ ID NO :7所示核苷酸序列（GeneBank編號(hào)為 NM_001145454. 1的第81位至第321位堿基）的重組pUC57質(zhì)粒載體，B2M標(biāo)準(zhǔn)品為含有 SEQ ID NO :8所示核苷酸序列（GeneBank編號(hào)為NM_004048. 2的第300位至550位堿基） 的重組PUC57質(zhì)粒載體。
[0018] pUC57載體可直接購(gòu)買市售商品，重組pUC57載體按照現(xiàn)有已知構(gòu)建重組載體的 技術(shù)進(jìn)行即可。
[0019] 優(yōu)選地，試劑盒中還包括TaqMan? Fast Advanced Master Mix, PCR緩沖液和 dNTPs。TaqMan? FastAdvanced Master Mix為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。
[0020] 優(yōu)選地，試劑盒中試劑分裝為以下四組：
[0021] STMNl 8 聯(lián) PCR 反應(yīng)條：每一聯(lián)的管中含有TaqMan? Fast Advanced Master Mix，檢測(cè)STMNlmRNA表達(dá)量的引物和Taqman探針，10XPCR緩沖液，dNTPs，礦物油和超純 水；
[0022] B2M 8 聯(lián)PCR反應(yīng)條：每一聯(lián)的管中含有 TaqMan? Fast Advanced Master Mix， B2M的擴(kuò)增引物和Taqman-MGB探針，10XPCR緩沖液，dNTPs，礦物油和超純水；
[0023] STMNl標(biāo)準(zhǔn)品：梯度濃度的STM