偶氮鎓二醇鹽一氧化氮供體型冬凌草甲素衍生物、制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物及藥物化學領(lǐng)域，具體涉及一類偶氮鑰二醇鹽一氧化氮供體 型冬凌草甲素衍生物。本發(fā)明還公開了這些偶氮鑰二醇鹽一氧化氮供體型冬凌草甲素衍生 物的制備方法以及這類一氧化氮供體型冬凌草甲素衍生物用于抗腫瘤的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]冬凌草甲素(oridonin)是從唇形科香茶菜屬(Rabdosia)植物冬凌草中分離得到 一種貝殼杉稀二砲類(ent-kaurene diterpenoid)天然有機化合物，具有清熱解毒、活血化 瘀、抗菌消炎、抗腫瘤等功效。體外活性研究表明，冬凌草甲素具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導 細胞凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤細胞信號通路、清除細胞內(nèi)自由基和抑制毒性物誘變細胞DNA等作用 (王珍妮，沃興德，中國醫(yī)藥導報，2008,28,14)。
[0003] 冬凌草甲素屬于二萜類化合物，不溶于水，限制了其在臨床上的應用。我們課題組 前期對冬凌草甲素 C-1和C-14位進行了結(jié)構(gòu)修飾，得到了活性較好的抗腫瘤化合物（見 ZL200710133915.X；Jinyi Xu?JingYi Yang?et al.Bioorg.Med.Chem Lett?2008?18： 4741)；
[0004] -氧化氮(NO)氣體分子在不同條件下具有促瘤和抗瘤的作用，這種雙重作用取決 于N0生成的濃度、時間和效應部位。持續(xù)低濃度的N0可以促進細胞的生長，高濃度的N0則通 過產(chǎn)生細胞毒性而發(fā)揮抗瘤活性。偶氮鑰二醇鹽化合物在體內(nèi)能釋放出高濃度N0。鑒于冬 凌草甲素的抗腫瘤活性不夠突出，根據(jù)孿藥原理，我們設計合成了偶氮鑰二醇鹽結(jié)合的冬 凌草甲素衍生物，以得到具有冬凌草甲素和N0供體雙重作用的新型抗腫瘤活性化合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了偶氮鑰二醇鹽一氧化氮供體型冬凌草甲素衍生物，通過對冬凌草甲 素衍生物的C-14位進行結(jié)構(gòu)修飾和改造，得到通式I結(jié)構(gòu)的新型冬凌草甲素衍生物或其可 藥用鹽。
[0006]通式I所示一氧化氮供體型冬凌草甲素衍生物或其可藥用鹽：
[0008]其中R1代表羥基、氧代、脂肪或芳香族酰氧基、磺酰氧基及取代磺酰氧基、磷酰氧 基及取代磷酰氧基或糖苷及取代糖苷；
[0009 ] R2 代表(CH2) 2、（ CH2) 3、C6H4、CH=CH、CH2C (CH3) 2CH2;
[0010] R3代表氫、未取代或取代的12直鏈烷基、未取代或取代的C3- 12支鏈烷基、未取代 或取代的CH2直鏈烯基、未取代或取代的(：3-12支鏈烯基、未取代或取代的芐基、未取代或取 代的CH芳基烷基、未取代或取代的雜芳基；
[0011] R4代表氫、未取代或取代的12直鏈烷基、未取代或取代的C3- 12支鏈烷基、未取代 或取代的CH2直鏈烯基、未取代或取代的(：3-12支鏈烯基、未取代或取代的芐基、未取代或取 代的芳基烷基、未取代或取代的雜芳基，或NR 3R4為取代或未取代吡咯烷基、嗎啉基，哌啶 基、哌嗪基。
[0012] 本發(fā)明通式I的一氧化氮供體型冬凌草甲素衍生物或其鹽。
[0013] 其中R1優(yōu)選代表羥基、氧代、乙酰氧基；
[0014] R2 優(yōu)選代表(CH2)2、（CH2)3;
[0015] NR3R4優(yōu)選代表吡咯烷基、嗎啉基。
[0016]本發(fā)明的部分化合物為：
[0017] ent-la，6β，7β_三羥基-(14β-0-( α-吡咯-卜基-02-甲氧基?；嫉€二醇鹽）丙 酰基））-15-氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0018] ent-la，6i3,7i3-三羥基-(14β-0-((1-吡咯-1-基-02-甲氧基?；嫉€二醇鹽)丁 酰基））-15-氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0019] ent-la，6β，7β_三羥基_(14β-0-( a_嗎啉-卜基-02-甲氧基?；嫉€二醇鹽）丙 酰基））-15-氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0020] ent-la，6i3,7i3-三羥基-(14β-0-((1-嗎啉-1-基-02-甲氧基?；嫉€二醇鹽)丁 ?；?15-氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0021 ] ent_6i3，7β-二羥基-(14β-0-( (1-吡咯-1-基-02-甲氧基?；嫉€二醇鹽）丙酰 基））-1，15-二氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0022] ent-6i3,7i3_二羥基-(14β-0_((1-吡咯-1-基-02-甲氧基?；嫉€二醇鹽）丁酰 基））-1，15-二氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0023] ent-6i3,7i3_二羥基_(14β-0-(1-嗎啉-1-基-02-甲氧基?；嫉€二醇鹽）丙酰 基））-1，15-二氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0024] ent-6i3,7i3_二羥基-(14β-0_((1-嗎啉-1-基-02-甲氧基?；嫉€二醇鹽）丁酰 基））-1，15-二氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0025] ent-la-乙酰氧基-6β，7β_二羥基-(14β-0_((1-吡咯-1-基-02-甲氧基酰基偶氮鑰 二醇鹽)丙?；?15-氧代-7,20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0026] ent-la-乙酰氧基-6β，7β_二羥基-(14β-0_((1-吡咯-1-基-02-甲氧基?；嫉€ 二醇鹽)丁?；?15-氧代-7,20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0027] ent-la-乙酰氧基-6β，7β_二羥基-(14β-0_((1-嗎啉-1-基-02-甲氧基?；嫉€ 二醇鹽)丙酰基））-15-氧代-7,20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0028] ent-la-乙酰氧基-6β，7β_二羥基-(14β-0_((1-嗎啉-1-基-02-甲氧基酰基偶氮鑰 二醇鹽)丁?；?15-氧代-7,20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0029] 本發(fā)明的偶氮鑰二醇鹽一氧化氮供體型冬凌草甲素衍生物I可用下列方法制備得 到：
[0030] a、將一氧化氮通入到吡咯烷或嗎啉環(huán)甲醇溶液中，加入乙醇鈉，加入納米級的二 氧化鈦作為催化劑，在常溫常壓下攪拌48小時；
[0031 ] b、將步驟a產(chǎn)物加入氯甲基甲硫醚，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，碳酸鈉，常溫攪拌， 乙酸乙酯萃取，過濾，有機層用Na2S04干燥，濃縮，柱層析；
[0032] c、將步驟b產(chǎn)物溶于二氯甲烷，冰浴條件下加入磺酰氯，攪拌。lOmin后，撤去冰浴， 常溫攪拌30min，旋干；
[0033] d、將冬凌草甲素及其各衍生母核溶于二氯甲烷中，加入EDCI、EMAP、丁二酸酐或戊 二酸酐，常溫攪拌；
[0034] e、將步驟b產(chǎn)物于無水DMF中，加入無水Na2C03，常溫攪拌，將步驟d產(chǎn)物分次緩慢加 入其中。乙酸乙酯萃取，用少量水洗滌，合并有機層用無水Na2S04干燥，濃縮，柱層析。
[0035]下面是本發(fā)明部分化合物的藥理實驗結(jié)果：
[0036] 實驗設備與試劑
[0037] 儀器超凈工作臺（蘇州艾可林凈化設備有限公司）
[0038] 恒溫C02培養(yǎng)箱（日本SANYO)
[0039] 酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIO-RAD)
[0040] 倒置生物顯微鏡（日本OLYMPUS)
[0041] 試劑青、鏈霉素混合液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）
[0042] 胰蛋白酶消化液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）
[0043] PBS(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）
[0044] MTT(BIOSHARP)
[0045] DMS0(SIGMA)
[0046] 細胞株人肝癌細胞Be 1-7402,人乳腺癌細胞MCF-7,人白血病
[0047] 細胞 K562 [0048]實驗方法
[0049] 1.細胞消化、計數(shù)、制成濃度為5X 104個/mL的細胞懸液，96孔板中每孔加入100yL 細胞懸液(每孔5 X 103個細胞）；
[0050] 2.96孔板置于37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;
[0051 ] 3.用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100yL相應的含藥培養(yǎng)基，同時設 立陰性對照組，溶媒對照組，陽性對照組；
[0052] 4 · 96孔板置于37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h;
[0053] 5 ·將96孔板進行MTT染色，λ = 490ηπι，測定0D值。
[0054] 1)每孔加入20yL MTT(5 mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h;
[0055] 2)棄去培養(yǎng)基，每孔加入150yL DMS0溶解，搖床lOmin輕輕混勻;λ = 490ηπι，酶標儀 讀出每孔的0D值，計算抑制率。
[0057]實驗結(jié)果
[0058]表1實施例對3種人類癌細胞株抗增殖活性的IC5Q值(μΜ)
[0061] -氧化氮體外釋放試驗證明，本發(fā)明的一氧化氮供體型冬凌草甲素衍生物具有較 好的體外釋放活性，與抗腫瘤活性呈協(xié)同作用。
[0062] 所有受試物均溶于DMS0,用DMS0溶解后的儲備濃度為10-Vol/L，然后用磷酸緩沖 液(pH 7.4)稀釋，使其終濃度為ΙθΛιοΙ/L。根據(jù)試一氧化氮劑盒說明，將樣品與配好的試劑 混合，37°C孵化10_60min，于不同時間點取反應液lml，充分旋渦混勻30秒，室溫靜置40min， 4000轉(zhuǎn)/分，離心10min，取上清加入顯色劑，混勾，室溫靜置lOmin，550nm，酶標儀測定各管 吸光度。于550nm處檢測吸光度。


【具體實施方式】：
[0066] 實施例1
[0067] ent-la，6i3,7i3_三羥基-(14β-0_((1-吡咯-1-基-02-甲氧基?；嫉€二醇鹽)丙 酰基））-15-氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯
[0068] 將現(xiàn)制的1-吡咯-1基-02-氯甲基偶氮鑰二醇鹽溶于無水DMF中，加入無水Na2C0 3 (leq.)，常溫攪拌，將ent-la，6β，7β_三羥基_(14β-0-?；?-15-氧代-7，20-氧橋-16-貝殼杉烯分次緩慢加入其中，TLC監(jiān)測反應，直至反應原料消失。乙酸乙酯萃取，用少最水洗 滌多次，合并有機層用無水Na 2S〇4干燥，濃縮，柱層析(DCM: MeOH = 200:1 v/v)，得白色固體 (收率11·2%)</Η NMR(300 MHz，CDCl3)S(ppm)6.09(s，2H)，5.84(s，lH)，5.67(dd，J=14.3， 7.1Hz，2H)，5.47(s，lH)，5.24(s，lH)，4.24(d，J=10.3 Hz，lH)，3.99(d