陽性擴 增，Ct值為23.65,有S形擴增曲線。陰性樣品則無擴增曲線。從擴增曲線上可以看到，在擴增 的前期，特別是在熒光臨界值(threshold)附近，曲線重合性較好。
[0045] 實施例2、熒光定量PCR檢測豬德爾塔冠狀病毒的特異性和敏感性驗證 [0046] 1、特異性驗證
[0047]利用總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司，貨號DP419)提取豬德爾塔冠 狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒基因組RNA。將提取的豬德爾塔冠狀病毒、 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒基因組RNA作為模板，滅菌去離子水作為陰性對 照，進行本發(fā)明所述的Taqman探針法熒光定量PCR反應，記錄結果。其中豬德爾塔冠狀病毒 RNA樣品做了 1次重復。
[0048] 結果如圖2所示，豬德爾塔冠狀病毒RNA模板在24.51Ct處有擴增，擴增曲線呈S形， 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒RNA模板以及陰性對照樣品無非特異性擴增。所得 結果與預期完全吻合。
[0049] 2、敏感性驗證
[0050] 將濃度為1 X 108PFU/mL的豬德爾塔冠狀病毒液進行10倍梯度稀釋。提取1 X 108PFU/mL-l X K^PFU/mL各梯度濃度德爾塔冠狀病毒的基因組RNA作為模板，無菌水作為陰 性對照，進行Taqman探針法焚光定量PCR反應。
[0051 ] 結果顯示，20μ1反應體系中，最低檢測樣本濃度為1 X H^PFU/mL，Ct值為37.53，如 圖3所示，在最佳反應條件下，最低檢測限lXIOkFU/mL的基因組RNA起始模板的Ct值大約 為37.53,因此反應循環(huán)數(shù)40可大大滿足最低檢測要求。從不同濃度起始模板的擴增曲線可 以看出，S曲線基線平整，指數(shù)區(qū)明顯，斜率較大，這些均說明在該條件下模板的擴增是較為 理想的。
[0052] 實施例3:豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒的制備及檢測
[0053] 1、試劑盒的制備：
[0054] 配制如下試劑并保存。
[0055] 試劑1:豬德爾塔冠狀病毒熒光PCR反應液lmL;
[0056]
[0057]
[0058] 試劑3:陽性對照(豬德爾塔冠狀病毒基因組CDNA)lmL;
[0059] 試劑4:陰性對照(滅菌去離子水）lmL。
[0060] 2、試劑盒的穩(wěn)定性分析
[0061] 選取3個已知陽性的樣品，分別進行批內重復檢測和批間重復檢測。批內重復檢 測:將3個已知陽性樣品在同一批實驗中進行，每個樣品設置3個重復。批間重復實驗:將3個 已知陽性樣品分批次檢測，每個樣品單獨檢測，每個樣品設置3個重復。
[0062]每管豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR反應體系為20μ1:需17.92μ1試劑1，1.08μ1試 劑2，陽性樣品、試劑3(陽性對照)或試劑4(陰性對照）ΙμL。
[0063] Taqman探針法熒光定量PCR擴增反應條件為：50°C30min，為第一步循環(huán)；92°C 3min，為第二步循環(huán)；92°C10S，60°C20S，68°C20s為第三步45個循環(huán)，所述第三步每個循環(huán) 的延伸結束時進行熒光信號檢測，并記錄實驗結果。
[0064]從表1中的檢測結果分析，可以看出批內變異系數(shù)在0.70 %-0.86%之間，批間變 異系數(shù)在〇. 96 % -1.56 %之間，說明本試劑盒穩(wěn)定性良好。
[0065]表1試劑盒穩(wěn)定性分析
[0066]
[0068] 由于采用了以上技術方案，本發(fā)明通過設計特異性引物和探針并優(yōu)化熒光定量 PCR的反應體系，發(fā)展了能夠快速、有效地檢測豬德爾塔冠狀病毒的熒光定量PCR的非診斷 性檢測方法，同時制備了基于該方法的檢測試劑盒，所述檢測方法準確性、特異性和敏感性 高，所述檢測試劑盒穩(wěn)定性好。
[0069] 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，本 領域技術人員利用上述揭示的技術內容做出些許簡單修改、等同變化或修飾，均落在本發(fā) 明的保護范圍內。 .序列表 <110>北京億森寶生物科技W限公司 <120〉豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒及非沴斷性檢測方讓 <130：-> 20.15 <160> 4 <170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <2Π> 18 <212> ；DM <213/ .人工.合成 <400〉丄 Hgccacceac eaaaoeaa： .1.8' <21?'> 2 <211:，'2:3. <212> ΜΑ
[0070] <2]3，人X合成 κ400> 2 ?gggtttagc agactggtct tgt 2.3 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> 人工合成 <400> 3 taaggacaag ：aagG.ctgac: 19 <210 4： ^2L1> ：63 <^212/ DNA -2LH> Porcine： deltacorona-yirus <400 > 4 agccacceac c.aaaccaact aaggaccago agcctgacaa acaagaccag tctgctaaaG 60 c:ca 63
【主權項】
1. 豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，包括PCR反應液，其特征在于，所述PCR 反應液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探針： 上游引物:5 ' -AGCCACCCACCAAACCAA-3 '， 下游引物：5 ' -TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3 '， Taqman探針：5 ' -TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3 '。2. 根據(jù)權利要求1所述的豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所 述Taqman探針的核苷酸序列的3 '端標記MGB熒光淬滅基團。3. 根據(jù)權利要求2所述的豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所 述Taqman探針的核苷酸序列的5 '端標記FAM熒光報告基團。4. 根據(jù)權利要求1所述的豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒還包括酶混合物，所述酶混合物包含HotMaster Taq DNA polymerase和Quant RTase〇5. 根據(jù)權利要求1-4任一項所述的豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征 在于，所述試劑盒還包括陽性對照，所述陽性對照為豬德爾塔冠狀病毒基因組cDNA。6. 豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR非診斷性檢測方法，其特征在于，采用具有如下核苷 酸序列的引物和Taqman探針進行熒光定量PCR: 上游引物:5 ' -AGCCACCCACCAAACCAA-3 '， 下游引物：5 ' -TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3 '， Taqman探針：5 ' -TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3 '。7. 根據(jù)權利要求6所述的豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR非診斷性檢測方法，其特征在 于，所述Taqman探針的核苷酸序列的3 '端標記MGB熒光淬滅基團。8. 根據(jù)權利要求6所述的豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR非診斷性檢測方法，其特征在 于，所述Taqman探針的核苷酸序列的5 '端標記FAM熒光報告基團。9. 根據(jù)權利要求6所述的豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR非診斷性檢測方法，其特征在 于，所述熒光定量PCR的20μ1反應體系包括:上游引物0.4μ1;下游引物0.4μ1; Taqman探針 0·8μ1;檢測樣品 RNA lyl;2XQuant One Step Probe qRT-PCR Master Mix 10μ1; Ho tMaster Taq DNA polymerase 0·8μ1; Quant RTase 0·28μ1;余量為滅菌去離子水。10. 根據(jù)權利要求6-9任一項所述的豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR非診斷性檢測方 法，其特征在于，所述熒光定量PCR反應條件為:50°C30min，為第一步循環(huán);92°C 3min，為第 二步循環(huán);92°C 10s，60°C 20s，68°C 20s為第三步45個循環(huán)，所述第三步每個循環(huán)的延伸 結束時進行熒光信號檢測。
【專利摘要】本發(fā)明公開了豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒及非診斷性檢測方法，所述試劑盒包括PCR反應液，所述PCR反應液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探針：上游引物：5’-AGCCACCCACCAAACCAA-3’，下游引物：5’-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3’，Taqman探針：5’-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3’。本發(fā)明能夠快速、有效地檢測豬德爾塔冠狀病毒，所述非診斷性檢測方法準確性、特異性和敏感性高，所述檢測試劑盒靈敏、穩(wěn)定、有效。
【IPC分類】C12Q1/70, C12Q1/68
【公開號】CN105567874
【申請?zhí)枴緾N201610091833
【發(fā)明人】王新杰, 高姍姍, 孫曉明, 胡祥鈺
【申請人】北京億森寶生物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年2月19日