30?50ml。同時采集150-200ml外周血，立即于低溫條件下送到GMP實驗室。
[0021 ] (2)發(fā)明所用試劑:DMEM、AMEM和PBS購自GIBCO公司。胰蛋白酶購自Invirogen公司。青霉素和鏈霉素購自Sigma公司。發(fā)明中所用骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液比例為:90%的DMEM或者AMEM、10%自體PRP、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。
[0022](3)BMSCs的分離提取:將骨髓450rpm/min離心6-8min，含有有核細胞的上半部應(yīng)非常透明，下半部分為有血紅細胞(RBC)沉淀的骨髓液。上半部轉(zhuǎn)移到新的錐形管，1500rpm/min離心6min后取出有核細胞沉淀。將上清與RBC骨髓液混合，再次離心以得到更多有核細胞。用一定量PBS重懸有核細胞，得到細胞懸液并進行計數(shù)。
[0023](4)自體PRP的制備:將患者自體外周血在450rpm/rpm下離心20min。離心后小心取出不含任何RBCs的上層血清，獲得自體PRP。
[0024](5)自體PL的制備:將制備的PRP立刻置于_20°C下進行冷凍，冷凍后立即放入37°C水浴中解凍，獲得PL。
[0025](6)不含血小板的血清(PPP)制備:將制備PRP后剩余的外周血在1500rpm/min下離心lOmin，小心將不含有RBCs的上清取出，得到PPP，并立即冷凍保存。
[0026](7)自體BMSCs的分離提取與培養(yǎng)擴增:將BNCs分離提取步驟中獲得的細胞接種到培養(yǎng)瓶中。加入DMEM+10%自體PL的培養(yǎng)液置于37°C、飽和濕度、5%的⑶2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)開始原代培養(yǎng)，每2?3天更換一次培養(yǎng)液，去除未貼壁的細胞。培養(yǎng)7天左右時，用0.25%胰酶消化后離心收集細胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)傳代所用培養(yǎng)液為AMEM+10%自體PL。
[0027](8)骨髓間充質(zhì)干細胞的凍存:將準備凍存的骨髓間充質(zhì)干細胞于凍存前一日全部換液。將自體PPP和99%二甲基亞砜按體積比9:1的比例緩慢混勻配成凍存液，放入冰水混合物中預冷15?20min。利用凍存液懸浮BMSCs沉淀，并將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到凍存管中，利用程序降溫儀將細胞降溫至_80°C后轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存。
[0028]【具體實施方式】二:骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定。
[0029]將第P2或P3代的BMSCs用0.25%胰酶進行消化后，用PBS洗2次，制備成I X 10%1細胞懸液，分別加入熒光標記的0)45工034、0)44工071、0)105、0)106、0)29、0)90單克隆抗體，4°C下孵育30min，PBS洗2次，加入500μ1的PBS混合均勻后進行流式細胞儀檢測，同時設(shè)立同型IgG對照管。從結(jié)果可以分析出，3、4、5代的BMSCs的CD44、CD71、CD105、CD106等成抗原陽性，CD45和CD34成陰性，證明所培養(yǎng)后的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0030]【具體實施方式】三:治療用細胞制劑的制備。
[0031 ] 收集P2~P3代BMSCs，每Iml細胞制劑所含物質(zhì)包括:I?3 X 16個BMSCs、Iml自體PRP、20?50mmol的CaCl2、10?50單位的凝血酶、10?30ug表皮生長因子、1ug環(huán)丙沙星，制備后的細胞制劑必須在24h內(nèi)使用。細胞制劑可通過噴涂或?qū)⑵涓街趧?chuàng)傷敷料上作用于患者皮膚損傷部位。
[0032]具體治療實例一:自體BMSCs治療嚴重皮膚損傷臨床試驗。
[0033]1.病例選擇:選取糖尿病足患者，進行常規(guī)檢測后，經(jīng)患者簽署知情通知書進行臨床治療。
[0034]2.治療方法:采集患者骨髓并分離提取骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)體外擴增培養(yǎng)BMSCs后根據(jù)患者傷口部位大小及潰爛程度進行對應(yīng)劑量的細胞制劑的制備。術(shù)前取30ul的細胞制劑對患者進行皮試，觀察有無異常反應(yīng)。皮試無異常反應(yīng)后，用本發(fā)明制備的細胞制劑噴涂于患者傷口表面，每Icm2損傷面積使用0.1ml細胞制劑。3小時內(nèi)觀察患者傷口部分是否有疼痛或紅腫等異常狀況發(fā)生。
[0035]3.治療效果分析:患者在接受治療后的第4周、第8周、第12周、第24周后進行復查，觀察傷口部位的愈合情況。結(jié)果表明:通過本發(fā)明治療后，患者皮膚損傷部位愈合情況良好。治療后愈合部位無明顯疤痕存在，更接近于治療前自身皮膚性狀。
【主權(quán)項】
1.一種利用自體骨髓間充質(zhì)干細胞治療嚴重皮膚損傷的方法，其特征在于采集患者自體骨髓進行BMSCs的分離提取和培養(yǎng)擴增，并利用自體血小板裂解液(PL)加入培養(yǎng)液中進行細胞培養(yǎng)，實現(xiàn)完全自體干細胞技術(shù)的利用。2.如權(quán)利要求書I所述，臨床治療的皮膚損傷包括:各種急慢性皮膚潰爛，糖尿病足，各種嚴重大面積皮膚損傷和燒傷，皮膚癌術(shù)后的皮膚愈合治療等。3.如權(quán)利要求書I所述，骨髓MSCs的分離采用直接密度梯度離心方法，在450rpm/min下離心20min。4.如權(quán)利要求書I所述，細胞培養(yǎng)液為90%的DMEM外加10%自體PL和AMEM添加10%自體PU其中含有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。5.如權(quán)利要求書I所述，自體富含血小板的血清(PRP)是通過患者自體外周血在450rpm/min下離心20min后，取上清部分獲取。6.如權(quán)利要求書I和5所述，自體PL是將已制備的PRP立刻置于-20°C下進行冷凍，冷凍后立即放入37°C水浴中解凍后獲得。7.如權(quán)利要求書I所述，凍存BMSCs所用的凍存液為自體不含血小板的血清(PPP)和二甲基亞砜，比例為9:1。8.如權(quán)利要求書I和7所述，自體PPP制備是由制備PRP后剩余的外周血經(jīng)1500rpm/min離心I Omin后獲得。9.一種利用自體骨髓間充質(zhì)干細胞治療各種嚴重皮膚損傷的方法，其特征在于利用擴增的BMSCs制備細胞制劑，并用于皮膚損傷的治療。10.如權(quán)利要求書9所述，制備細胞制劑所用BMSCs為P2或P3代細胞。11.如權(quán)利要求書9所述，根據(jù)損傷面積選擇細胞制劑量用于治療患者，每平方厘米損傷面積所用細胞制劑量為0.1毫升。12.如權(quán)利要求書9所述，每Iml細胞制劑所含物質(zhì)包括:1-3X 16個BMSCs、Iml自體PRP、20~50mmol的0&(:12、10~50單位的凝血酶、10~301^表皮生長因子、10叫環(huán)丙沙星，制備后的細胞制劑必須在24h內(nèi)使用。13.如權(quán)利要求書9所述，細胞制劑可利用針管噴涂移植到患者皮膚損傷部位。14.如權(quán)利要求書9所述，細胞制劑也可通過附著于創(chuàng)傷敷料上帖服于損傷處。
【專利摘要】本文詳細提供了一種利用自體骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）臨床治療各種嚴重皮膚損傷的新方法，包括BMSCs的分離、提取、培養(yǎng)、擴增和細胞制劑的制備及臨床操作方法。本發(fā)明基于BMSCs能分泌促使內(nèi)皮細胞生長的細胞因子和分化成新的皮膚組織細胞的潛能及其消炎作用、再生損傷的皮膚組織的特點；其優(yōu)勢在于BMSCs具有自體來源避免了倫理學爭議，無免疫排斥反應(yīng)、易于操作且無傳染風險等。此方法治療時間短，再生修復效果佳，彌補了目前臨床常用治療方法對嚴重皮膚損傷治愈率低的缺點。
【IPC分類】A61P17/00, A61K35/28, A61P17/02, A61P3/10, C12N5/0775
【公開號】CN105596372
【申請?zhí)枴緾N201510928598
【發(fā)明人】李永忠, 王鳳權(quán), 孫岳
【申請人】天津衛(wèi)碩生物科技有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年12月15日