用t-test比較差異顯著性，沖<0.05差 異顯著，*沖<0.01差異極顯著。
[0042] 由上述實(shí)施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖活性具 有抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。全緣馬尾藻多糖SPSW濃度和時(shí)間依賴性方式顯著地抑制肺 癌A549細(xì)胞的體外增殖活性。不同濃度的全緣馬尾藻多糖SPS處理A549細(xì)胞24h后，對(duì)A549 細(xì)胞的增殖抑制率2%上升至92%，并且在SPS濃度為1.5mg/ml時(shí)其對(duì)A549細(xì)胞的抑制率高 達(dá) 92.1%。
[0043] 然而由上述實(shí)施例2制得的全緣馬尾藻多糖SPS-A在體外對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖 活性結(jié)果顯示，在SPS-A濃度為1.5mg/ml時(shí)其對(duì)A549細(xì)胞的抑制率只有39.1 %，因此選擇水 提全緣馬尾藻多糖(SPS)作為本發(fā)明原料。
[0044] 實(shí)施例4
[004引 SPS體外給藥誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡
[0046] 調(diào)亡細(xì)胞的染色質(zhì)呈現(xiàn)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和調(diào)亡小體等 典型的調(diào)亡形態(tài)。細(xì)胞調(diào)亡早期，憐醋酷絲氨酸(PS)外翻，Annexin V是對(duì)PS有高度親和力 的重組蛋白，可作為外翻的PS的特異性探針并作為早期調(diào)亡的標(biāo)志之一。
[0047] 實(shí)驗(yàn)方法
[0048] 取對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞，膜酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3 X 104個(gè)/ml;將 蓋玻片泡酸洗凈高壓滅菌后，放入12孔培養(yǎng)板中，注意防止染菌污染;取1ml制備好的細(xì)胞 懸液加到培養(yǎng)板中的蓋玻片上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);24h后，取出培養(yǎng)板，加入0， 0.2，0.4and 0.6mg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續(xù)培養(yǎng)；1化后，取出培養(yǎng)板，倒掉細(xì)胞上清液， 用4%多聚甲醒室溫固定lOmin，無菌PBS清洗Ξ次細(xì)胞;加入化echst 33258染色液室溫繼 續(xù)解育lOmin;巧光顯微鏡下觀察，隨機(jī)挑選Ξ個(gè)視野進(jìn)行拍照保存。
[0049] 同樣取對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞，膜酶消化成單細(xì)胞懸液，接種6孔板，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1 X 1〇6個(gè)/孔;24h后，加入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續(xù)培養(yǎng)；1化后，收集 A549細(xì)胞并用PBS清洗兩次，500μ1結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，分別加入扣1 Annexin V- 門TC and PI，室溫避光解育lOmin，即刻使用流式細(xì)胞儀檢測。
[0050] 由上述實(shí)施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生調(diào) 亡。結(jié)果如圖3A所示，A549細(xì)胞經(jīng)SPS處理12h并經(jīng)化echst 33258染色后，其細(xì)胞核出現(xiàn)了 典型的調(diào)亡形態(tài)學(xué)特征，包括:染色質(zhì)固縮、核碎裂、調(diào)亡小體形成等;Annexin V-FITC/PI 雙染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了SPS對(duì)A549細(xì)胞的調(diào)亡的誘導(dǎo)作用，結(jié)果如圖3B所示，不同濃度的 SPS處理肺癌A549細(xì)胞1化后，晚期（右上象限）和壞死(左上象限）的調(diào)亡細(xì)胞所占的比例分 別從0.7%上升至28.8% ,0.6%升高至12.7%。
[0051 ] 實(shí)施例5
[0052] SPS體外給藥誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞線粒體膜電位下降
[0053] 線粒體在內(nèi)源性的線粒體調(diào)亡通路中發(fā)揮重要作用，線粒體膜電位的降低受多種 壓力信號(hào)因子激活并且是細(xì)胞死亡級(jí)聯(lián)過程中不可逆轉(zhuǎn)的步驟，其被認(rèn)為是線粒體調(diào)亡通 路中的重要事件，同時(shí)也是細(xì)胞早期調(diào)亡的標(biāo)志之一。JC-1是一種膜滲透性的親脂性陽離 子巧光染料，其在線粒體內(nèi)表現(xiàn)出電勢(shì)依賴性的積聚。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基 質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色巧光;不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失， JC-1只能W單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色巧光。因此顏色的變化非常直接的反映出 線粒體膜電位的變化。
[0054]實(shí)驗(yàn)方法
[005引取對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞接種6孔板，調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為1 X 106個(gè)/孔;培養(yǎng)2地后，加 入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續(xù)培養(yǎng)；1化后，加入JC-1染料解育30min; 離屯、收集細(xì)胞沉淀，染色緩沖液洗兩遍，檢測緩沖液重懸后使用流式細(xì)胞儀檢測。
[0056] 由實(shí)施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞線粒體膜電 位的降低，結(jié)果見圖4,與對(duì)照組相比，SPS處理之后的A549細(xì)胞發(fā)射紅色巧光的細(xì)胞數(shù)明顯 降低而發(fā)射綠色巧光的細(xì)胞數(shù)顯著增加，說明了 A549細(xì)胞線粒體膜電位的降低。
[0057] 實(shí)施例6
[0058] SPS體外給藥誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生
[0059] 活性氧是線粒體氧化呼吸鏈的副產(chǎn)物并在細(xì)胞的氧化壓力中發(fā)揮重要作用，堆積 的活性氧會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白和脂質(zhì)，并最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性 氧的主要來源，活性氧的產(chǎn)生與線粒體膜電位的降低密切相關(guān)。過量的細(xì)胞內(nèi)活性氧破壞 線粒體膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞色素 C的釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并導(dǎo)致細(xì)胞的調(diào)亡產(chǎn) 生。
[0060] 實(shí)驗(yàn)方法
[0061] 將對(duì)數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞接種6孔板，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1 X 106個(gè)/孔;培養(yǎng)24h 后，加入0，0.4，0 . Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續(xù)培養(yǎng)；1化后，加入活性氧探針 DCFH-DA解育20min，無血清培養(yǎng)基洗Ξ次后，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。
[0062] 由上述實(shí)施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞活性氧 的產(chǎn)生。與對(duì)照組A549相比，SPSW濃度依賴性的方式誘導(dǎo)A549細(xì)胞的活性氧水平的顯著增 加 (圖 5A，B)。
[0063] 實(shí)施例7
[0064] SPS體外給藥誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞產(chǎn)生周期阻滯
[0065] 細(xì)胞周期分布被認(rèn)為是細(xì)胞存活、生長和增殖的主要參數(shù)之一。不受控的細(xì)胞增 殖是腫瘤的典型特征，所W細(xì)胞周期阻滯代表著腫瘤治療的主要祀標(biāo)。細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)是 檢測細(xì)胞周期各時(shí)相間轉(zhuǎn)換的主要調(diào)節(jié)機(jī)制。細(xì)胞周期的正常進(jìn)展若被各種細(xì)胞損傷影 響，細(xì)胞周期將會(huì)被阻滯在G2/M和S期。一旦細(xì)胞損傷不能被修復(fù)，細(xì)胞將停止異常的細(xì)胞 分裂而最終走向調(diào)亡或是壞死的過程。
[0066] 實(shí)驗(yàn)方法
[0067] 將對(duì)數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞接種6孔板，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1 X 106個(gè)/孔;培養(yǎng)24h 后，加入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續(xù)培養(yǎng)；1化后，細(xì)胞通過離屯、收集， 經(jīng)由冰浴的PBS洗涂兩次后，用70%預(yù)冷的酒精于4°C固定12h;固定的A549細(xì)胞離屯、收集并 用PBS洗兩次后，用PI(含化ase)于37°C避光解育30min，然后使用流式細(xì)胞儀檢測各個(gè)時(shí)相 的細(xì)胞數(shù)。
[0068] 由上述實(shí)施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞產(chǎn)生G2/ Μ細(xì)胞周期阻滯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6A，B所示，隨著SPS處理濃度的增加，G1期的細(xì)胞數(shù)從72.8% 下降到52.8%，而G2/M期的細(xì)胞數(shù)從12.3%上升到28.5%，說明了8?5誘導(dǎo)肺癌4549細(xì)胞 G2/M細(xì)胞周期阻滯。
[0069] 實(shí)施例8
[0070] SPS體外給藥對(duì)肺癌A549細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
[0071] 調(diào)亡是受到嚴(yán)格調(diào)控的一個(gè)生理過程，其設(shè)及明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化。在各 種腫瘤相關(guān)的蛋白中，促調(diào)亡和抗調(diào)亡蛋白通常被作為調(diào)亡的分子標(biāo)記。作為調(diào)亡的誘導(dǎo) 者和調(diào)節(jié)者的腫瘤抑制蛋白P53,設(shè)及到DNA的損傷修復(fù)、細(xì)胞周期和調(diào)亡的控制等。Bcl-2 蛋白家族是調(diào)亡重要的調(diào)節(jié)者，并且在線粒體調(diào)亡通路中發(fā)揮著重要的作用。其中，Bcl-2 是該家族中抗調(diào)亡成員能抑制細(xì)胞色素 C從線粒體向胞質(zhì)的釋放，Bax是該家族中促調(diào)亡成 員能促進(jìn)細(xì)胞色素 C的釋放。而Bax/Bcl-2的比率是線粒體調(diào)亡通路中的關(guān)鍵檢查點(diǎn)，兩者 比率的升高意味著調(diào)亡產(chǎn)生。細(xì)胞色素 C一旦從線粒體釋放至胞質(zhì)內(nèi)，就會(huì)結(jié)合Apaf-1, ATP ,and procaspase-g形成調(diào)亡體復(fù)合物，激活起始者caspase-9和下游的效應(yīng)者 caspase-3,隨后誘導(dǎo)PARP切割然后執(zhí)行調(diào)亡過程，也即觸發(fā)caspase依賴性的線粒體調(diào)亡 通路的啟動(dòng)。
[007引實(shí)驗(yàn)方法
[0073] 將對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種六孔板，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1 X 106個(gè)/孔;培養(yǎng)2地后， 加入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續(xù)培養(yǎng)；1化后，離屯、收集細(xì)胞，通過血球 計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，加入相應(yīng)量的裂解緩沖液，沸水浴煮lOmin制備蛋白樣品；隨后蛋 白樣品通過10 % SDS-PAGE膠分離并轉(zhuǎn)移至NC膜上，隨之相繼解育一抗和二抗，最后加入ECL 發(fā)光液檢測各蛋白表達(dá)量的變化。
[0074] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，與對(duì)照組A549各蛋白的表達(dá)量相比，SPS處理A549細(xì)胞之后， 細(xì)胞P53蛋白的表達(dá)量顯著升高，說明SI^對(duì)A549細(xì)胞調(diào)亡的誘導(dǎo)設(shè)及P53相關(guān)的信號(hào)通路； Be 1 -2表達(dá)量降低、Bax表達(dá)量升高，故Bax/Bc 1 -2的比率顯著增加，表明SI^誘導(dǎo)的線粒體調(diào) 亡通路是通過對(duì)Bax/Bd-2比率的上調(diào)的方式來實(shí)現(xiàn)的；此外，SPS處理A549細(xì)胞后，其活性 形式，也即切割型的caspase-3, caspase-9和PARP的表達(dá)均顯著上升，進(jìn)一步說明了 SF*S誘 導(dǎo)A549細(xì)胞線粒體調(diào)節(jié)的調(diào)亡。
[007引實(shí)施例9
[0076] SPS體外給藥對(duì)人廝靜脈