一種慢生型大豆根瘤菌保護劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種大豆根瘤菌保護劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 在大豆生產(chǎn)過程中使用根瘤菌接種劑是一項成熟的技術(shù)，在增加產(chǎn)量、提高大豆 品質(zhì)等方面已得到廣泛的認可。據(jù)文獻報道國外使用根瘤菌接種劑的大豆田占總播種面積 的30~50%，有些國家可以達到70%以上甚至更高；而我國接種根瘤菌劑的面積僅占播種 面積的1~3%。近年來黑龍江省政府為加快推廣大豆根瘤菌技術(shù)，促進大豆增產(chǎn)提質(zhì)、節(jié)本 增效，每年拿出500萬元財政資金，在全省大豆主產(chǎn)區(qū)以補貼和自籌相結(jié)合的方式推廣大豆 根瘤菌接種劑技術(shù)，并結(jié)合大豆高產(chǎn)創(chuàng)建、科技示范園區(qū)建設(shè)、大豆測土配方施肥等辦法推 動大豆優(yōu)質(zhì)化生產(chǎn)。國內(nèi)從事根瘤菌研究的機構(gòu)和人員不勝枚舉，研究的方向、領(lǐng)域和取得 的科研成果數(shù)不勝數(shù)，但實際應(yīng)用卻少得可憐。根瘤菌劑應(yīng)用不廣泛的原因有很多，其中一 個主要原因就是大豆根瘤菌劑產(chǎn)品在土壤中不能形成比較優(yōu)勢，在土壤中的存活率低，與 土著根瘤菌相比競爭力弱，造成使用效果不理想。在使用根瘤菌接種劑的同時配伍使用保 護劑可以解決這一問題。
[0003] 作為中國綠色大豆的主產(chǎn)區(qū)，近年來黑龍江省始終保持每年4000萬畝左右的大豆 種植面積，農(nóng)墾九三管理局和黑河地區(qū)作為全國非轉(zhuǎn)基因大豆主產(chǎn)區(qū)，多年來始終致力于 綠色大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展，先后投入10億多元用于綠色大豆標準化基地建設(shè)，建立非轉(zhuǎn)基因大豆 核心示范區(qū)。目前這一區(qū)域內(nèi)大豆種植面積在2000萬畝以上，年產(chǎn)量達到200萬噸以上。但 根瘤菌劑的應(yīng)用還很少，僅占播種面積的2%左右，根瘤菌劑應(yīng)用前景廣闊。
[0004] 大豆根瘤菌劑保護劑是一種與根瘤菌劑配合使用的活性物質(zhì)，對根瘤菌劑具有營 養(yǎng)和保護作用，并能夠促進根瘤菌劑在大豆種子表面成膜和保持一定的種群優(yōu)勢，提高根 瘤菌劑的使用效果。由于根瘤菌的多樣性，針對每一種根瘤菌劑，應(yīng)該有專門的保護劑。
[0005] 目前，對根瘤菌劑保護劑的研究報道還不多見。而且大部分研究的重心放在了對 菌劑的保存期和保藏效果上，而不是提高大豆種子表面成膜能力、形成菌群優(yōu)勢、促進結(jié)瘤 等方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明利用響應(yīng)面法研究具有根瘤菌保護作用的蛋白類、鹽類、糖類和微量元素 類物質(zhì)，通過不同種類、不同組合、不同配比、不同濃度的比較分析，在實驗室中模擬實際應(yīng) 用條件，提供一種具有提高根瘤菌存活率和存活時間作用的慢生型大豆根瘤菌保護劑。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0008] -種慢生型大豆根瘤菌保護劑，由YMA培養(yǎng)基、蛋白胨、黃原膠、KaCl、硼酸制成，其 中：蛋白胨的含量為〇. 1~〇. 2wt%、黃原膠的含量為0.006~0.014wt%、KC1的含量為0.1~ 0.2￥七％、硼酸的含量為0~0.01￥七％。
[0009] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0010] 1、本發(fā)明提供的慢生型大豆根瘤菌保護劑中既有維持微生物滲透壓的鹽類、糖類 物質(zhì)，又有刺激菌劑和大豆生長的蛋白質(zhì)和微量元素，還有能夠有效成膜、促進根瘤菌在大 豆表面形成比較優(yōu)勢的蛋白類物質(zhì)，在實際應(yīng)用中會形成占位優(yōu)勢，抵御土著根瘤菌的侵 染，增加有效結(jié)瘤數(shù)量，提高接種根瘤菌劑的使用效果。
[0011] 2、與根瘤菌劑配伍使用，可以提高根瘤菌劑在土壤中的存活率，能在大豆種子表 面形成比較優(yōu)勢，抵御土著根瘤菌的競爭，減少無效結(jié)瘤，為最終實現(xiàn)大豆根瘤菌劑的大面 積推廣與應(yīng)用，提尚我省大?廣量和品質(zhì)打下基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0012] 下面對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù) 方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明 的保護范圍中。
【具體實施方式】 [0013] 一:本實施方式提供的慢生型大豆根瘤菌保護劑由YMA培養(yǎng)基(磷酸 氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0. lg，酵母提取物0.4g，甘露醇10g，瓊脂20g，ρΗ7.0，蒸餾 水1000ml)、蛋白胨、黃原膠、KaCl、硼酸制成，其中：蛋白胨的含量為0.1~0.2wt %、黃原膠 的含量為0.006~0.014wt%、KCl的含量為0.1~0.2wt%、硼酸的含量為0~O.Olwt%。
【具體實施方式】 [0014] 二:本實施方式與一不同的是，蛋白胨的含量為0.1~ 0.2￥七％、黃原膠的含量為0.006~0.014￥七％、1((：1的含量為0.1~0.2￥七％。
【具體實施方式】 [0015] 三：本實施方式與二不同的是，蛋白胨的含量為 0 · 18wt %、黃原膠的含量為0 · 008wt %、KC1的含量為0 · 12wt %。
【具體實施方式】 [0016] 四：本實施方式與二不同的是，蛋白胨的含量為 0.15￥七％、黃原膠的含量為0.012￥七％、1((：1的含量為0.18￥七％。
【具體實施方式】 [0017] 五:本實施方式與一不同的是，大蛋白胨的含量為0.1 ~0 · 2wt %、黃原膠的含量為0 · 006~0 · 014wt %、KC1的含量為0 · 1~0 · 2wt %、硼酸的含量為 0.005 ~O.Olwt%。
【具體實施方式】 [0018] 六：本實施方式與五不同的是，蛋白胨的含量為 0.15被％、黃原膠的含量為0.012被％、1((：1的含量為0.18被％、硼酸的含量為0.01被％。
【具體實施方式】 [0019] 七:本實施方式與五不同的是，蛋白胨的含量為0.18、 黃原膠的含量為0.008wt %、KC1的含量為0.12wt %、硼酸的含量為0.008wt %。
【具體實施方式】 [0020] 八:本實施方式提供了一種慢生型大豆根瘤菌保護劑，通過對血清 蛋白和蛋白胨等蛋白類物質(zhì)，氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣等鹽類，黃原膠、葡萄糖、蔗糖、海藻 糖等糖類，鉬酸銨、硼酸等微量元素進行單因素比較研究，以根瘤菌存活時間和存活率為指 標，確定各單因素的種類和濃度。采用響應(yīng)面法進行統(tǒng)計分析，復(fù)配保護劑配方，通過盆栽 實驗驗證，篩選保護劑組合。具體內(nèi)容如下：
[0021] 1.試驗材料與方法
[0022] 1.1試驗材料
[0023] 1.1.1培養(yǎng)基
[0024] YM培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0. lg，酵母提取物0.4g，甘露醇 10g，pH7 · 0，蒸饋水 1000ml。
[0025] YMA培養(yǎng)基:磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0. lg，酵母提取物0.4g，甘露醇 l〇g，瓊脂 20g，pH7 · 0，蒸餾水 1000ml。
[0026] 1.1.2供試菌種
[0027] 慢生型大豆根瘤菌;大豆品種：黑河43號。
[0028] 1.2試驗方法
[0029] 1.2.1慢生型大豆根瘤菌活化
[0030]取一環(huán)于_80°C保存的慢生型大豆根瘤菌，接種到裝有5mL的YM液體培養(yǎng)基的試管 中，于28°C，180rpm培養(yǎng)3d。用接種環(huán)將慢生型大豆根瘤菌菌液劃線接種到Y(jié)MA平板上，28°C 放置恒溫培養(yǎng)箱，倒置靜止培養(yǎng)7d左右直至出現(xiàn)單菌落為止。再挑取單菌落接種到Y(jié)M液體 培養(yǎng)基中，28 °C，180rpm培養(yǎng)3d待用。
[0031] 1.2.2慢生型大豆根瘤菌發(fā)酵培養(yǎng)
[0032] 挑取一環(huán)新鮮的平板種子接種于250ml的三角瓶中，裝液量為30ml，28°C180rpm振 蕩培養(yǎng)3d后，以2%的接種量接種于500ml的三角瓶中，裝液量為100ml，28°C 180rpm振蕩培 養(yǎng)3d后分裝到試管中，每支試管10ml。
[0033] 1.3活菌計數(shù)
[0034]平板菌落計數(shù)法:取100ul HW-05菌液樣品，加入裝有900ul無菌水的離心管中，即 為ΠΓ1稀釋液，再用200ul移液槍吸取ΠΓ1稀釋液100ul移入裝有900ul無菌水的離心管中， 即為10- 2稀釋液，以此類推，一定要注意每次更換槍頭，制成10-3、10-4、10- 5、10-6、10-7、10-8等 一系列稀釋度的菌液，供平板計數(shù)使用。分別涂布平板，28°C培養(yǎng)7d后計數(shù)。
[0035] 1.4篩選顯著因子
[0036] 采用不同種類、不同配比進行單因素、兩因素、三因素和四因素試驗，對蛋白類、鹽 類、糖類和微量元素四大類，12種化合物，即牛血清蛋白、蛋白胨、黃原膠、海藻糖、蔗糖、葡 萄糖、羧甲基纖維素鈉、似(：1、1((：1工 &(：12、鉬酸銨、硼酸進行全面考察。選擇12因子6水平的 試驗設(shè)計，每個因子取6個水平，使水平成梯度變化，檢測各梯度下的有效活菌數(shù)，從而確定 最大響應(yīng)面值的區(qū)域，篩選出顯著因子及最佳終濃度，最終篩選組合獲得效果較好的配方。 [0037] 表1-1不同種化合物
[0038]
[0039] 表1-2設(shè)計因子與水平
[0040]
[0042] 1.5響應(yīng)面分析
[0043] 確定了影響慢生型大豆根瘤菌的各主要因子，爬坡實驗確定了 3-4個主要因子響 應(yīng)區(qū)域的中心點，在主要因子的響應(yīng)區(qū)各取3-4個水平，設(shè)計3因素3水平和4因素3水平的響 應(yīng)面分析試驗。
[0044] 1.6數(shù)據(jù)分析
[0045] -個處理包含3個平行試驗，取值為3個平行試驗的均值。Plackett-Burman設(shè)計采 用Minitab 16軟件完成，Box-Behnken設(shè)計的響應(yīng)面分析由Design-Expert 8.0完成。
[0046] 1.7保護劑對根瘤菌的作用效果
[0047] 將四種經(jīng)響應(yīng)面分析優(yōu)化后的最佳終濃度的配比分別將培養(yǎng)好的慢