以海洋藻類為原料生產生物丁醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種以海洋藻類為原料，通過預處理糖 化海藻，得到海藻水解液，以海藻水解液為原料生產生物丁醇的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著化石能源、尤其是石油的逐漸枯竭。以生物能源為主的新型可替代能源的發(fā) 展勢在必行。丁醇是一種重要的平臺化學品，主要用于制造增塑劑或用作溶劑、萃取劑等； 近年來，研究人員發(fā)現丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當;其含氧量與汽油中常用的甲基叔丁 基醚相近;不會腐蝕管道、不易吸水，便于管道輸送;蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任 意比混合。所以，丁醇已成為被世界各國企業(yè)和研究機構強烈關注的一種極具潛力的新型 生物燃料[Durre，P.，Biobutanol :an attractive biofuel ·Biotechnol · J. 2007，2，（ 12)， 1525-34.]。其原料和生產工藝與生物乙醇相似，但生物丁醇的蒸汽壓力低，與汽油混合時 對雜質水的寬容度大，而且腐蝕性較小，與現有的生物燃料相比，能夠與汽油達到更高的混 合比（混合燃料中可混入20%的丁醇），而無需對車輛進行改造。丁醇還是一種高能量生物 燃料，與傳統(tǒng)燃料相比，每加侖可支持汽車多走10%的路程，與乙醇相比，可多走30%的路 程。生物丁醇的發(fā)酵原料以農作物為主，如專利"一種半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的方法"，使 用半連續(xù)發(fā)酵方法，以糖丁酸梭菌發(fā)酵甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及木質纖維素水解糖漿等糖質 原料制備生物丁醇過程中的應用，存在與人爭糧的問題。專利"一種以木薯為原料制取燃油 生物丁醇的方法"介紹了以薯為原料制備生物丁醇的方法，其又存在與地爭糧的問題。以農 業(yè)廢棄物為原料生產生物丁醇如專利"一種稻殼生產生物丁醇的方法"以及以"木質纖維素 原料聯產生物柴油與生物丁醇的方法"又有原料分散，不利于收集等弊端。以海洋藻類為原 料生產生物能源與傳統(tǒng)方法相比具有不與人爭地、不與地爭糧的優(yōu)勢。且擁有豐富的原材 料我國是海藻養(yǎng)殖大國，據不完全統(tǒng)計，在18000公里的沿海線上，我們分別栽培生產了占 全球90 %、80%以上的海帶、紫菜等經濟海藻，全球海藻總產量為1860萬噸，我國海藻產量 為1450萬噸，占全球總產量的78%。以海洋藻類生產生物丁醇具有諸多問題。首先藻類細胞 壁屏障影響細胞內多糖分解利用，海藻處理液中褐藻多酚等對菌體生長具有抑制作用等。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
[0004] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種生物丁醇的生產方法，其能夠克服以海洋藻類生 產生物丁醇的諸多問題，實現以預處理后的海藻為原料制備發(fā)酵培養(yǎng)基，以接種發(fā)酵生產 生物丁醇；
[0005] 為了實現根據本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種生物丁醇的生產方法， 其特征在于，以海藻為原料經預處理后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，以接種發(fā)酵生產生物丁醇。
[0006] 優(yōu)選的是，其中，以海藻為原料經預處理后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，在35-40Γ下連 續(xù)厭氧發(fā)酵72-120h以接種發(fā)酵生產生物丁醇，其中，菌種種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基的量占發(fā) 酵培養(yǎng)基總體積的6-12%。
[0007] 優(yōu)選的是，其中，以海藻為原料經預處理后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，在37°C下連續(xù)厭 氧發(fā)酵72h以接種發(fā)酵生產生物丁醇，其中，菌種種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基的量占發(fā)酵培養(yǎng)基 總體積的10 %。
[0008] 優(yōu)選的是，其中，所述海藻的含水量小于等于2%。
[0009] 優(yōu)選的是，其中，還包括將發(fā)酵培養(yǎng)基以裝量為發(fā)酵罐體積的55-75%加入發(fā)酵罐 中進行連續(xù)厭氧發(fā)酵。
[0010]優(yōu)選的是，其中，所述海藻預處理的具體方法包括以下步驟：
[0011] 6.1)將濃度為50-200g/L的海藻勻漿液固液分離后獲得海藻，向海藻中加入纖維 素酶進行糖化處理3d獲得酶解液，其中，纖維素酶的添加量為10-30FPU/g底物；以及 [0012] 6.2)將所述酶解液濃縮至原體積一半，用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0013] 優(yōu)選的是，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的具體配制方法為，將預處理后的海藻冷卻至室 溫，之后向其中依次加入硫酸銨磷酸、二氫鉀、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳和硫酸 鐵，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸銨磷酸、二氫鉀、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳和硫酸鐵 的濃度分別為 10-20g/L、2-10g/L、2-10g/L、1-1.5g/L、1-1.5g/L、0.02-0.048/1和0.02-〇 · 〇4g/L;之后，調節(jié)pH值為6 · 5-7 · 0，在115-121°C下滅菌15-30min，制得發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0014] 優(yōu)選的是，其中，所述菌種種子液的培養(yǎng)方法為：
[0015] 8.1)將菌種接種到一級液體培養(yǎng)基中，之后將接種有菌種的一級液體培養(yǎng)基在75 °C水浴lOmin，之后將其至于37°C厭氧培養(yǎng)至一級液體培養(yǎng)基中的菌體生長至0D600 = 0.8 時獲得一級菌液；
[0016] 8.2)將一級菌液轉接至二級液體培養(yǎng)基中37°(：厭氧培養(yǎng)至菌體生長至00600 = 0.2時停止發(fā)酵，獲得菌種種子液；
[0017] 其中，一級液體培養(yǎng)基與二級液體培養(yǎng)基的體積比為1:100。
[0018] 優(yōu)選的是，其中，所述一級液體培養(yǎng)基為液體RCM培養(yǎng)基，所述二級液體培養(yǎng)基為 液體CGM培養(yǎng)基。
[0019] 優(yōu)選的是，其中，所述菌種為丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum ATCC 824或者拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052中的一種或者兩種的等體積混 合物。
[0020] 本發(fā)明至少包括以下有益效果：
[0021] 本發(fā)明方法能夠以海洋藻類為原料生產生物能源丁醇，其與傳統(tǒng)方法相比具有不 與人爭地、不與地爭糧的優(yōu)勢;本發(fā)明方法中應用纖維素酶對海藻進行糖化預處理，破除了 藻類細胞壁屏障，實現了對海藻細胞內多糖分解利用，并且通過本發(fā)明方法克服了海藻處 理液中褐藻多酚等對菌體生長具有抑制作用，實現和提高了生物丁醇的高效產出，對促進 海洋藻類生物丁醇生產的產業(yè)化發(fā)展、以及環(huán)境保護、糧食安全保障具有重要意義。
[0022] 本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本 發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
【具體實施方式】
[0023] 下面對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據 以實施。
[0024] 應當理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術語并不配出一個或多 個其它元件或其組合的存在或添加。
[0025] -種生物丁醇的生產方法，其特征在于，以海藻為原料經預處理后用于制備發(fā)酵 培養(yǎng)基，以接種發(fā)酵生產生物丁醇。
[0026] 一個優(yōu)選方案中，以海藻為原料經預處理后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，在35-40°C下連 續(xù)厭氧發(fā)酵72-120h以接種發(fā)酵生產生物丁醇，其中，菌種種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基的量占發(fā) 酵培養(yǎng)基總體積的6-12%。
[0027] -個優(yōu)選方案中，以海藻為原料經預處理后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，在37°C下連續(xù) 厭氧發(fā)酵72h以接種發(fā)酵生產生物丁醇，其中，菌種種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基的量占發(fā)酵培 養(yǎng)基總體積的10 %。
[0028] -個優(yōu)選方案中，所述海藻的含水量小于等于2%。
[0029] -個優(yōu)選方案中，還包括將發(fā)酵培養(yǎng)基以裝量為發(fā)酵罐體積的55-75%加入發(fā)酵 罐中進行連續(xù)厭氧發(fā)酵。
[0030] -個優(yōu)選方案中，所述海藻預處理的具體方法包括以下步驟：
[0031] 6.1)將濃度為50_200g/L的海藻勻漿液固液分離后獲得海藻，向海藻中加入纖維 素酶進行糖化處理3d獲得酶解液，其中，纖維素酶的添加量為10_30FPU/g底物；以及
[0032] 6.2)將所述酶解液濃縮至原體積一半，用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0033] 優(yōu)選的是，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的具體配制方法為，將預處理后的海藻冷卻至室 溫，之后向其中依次加入硫酸銨磷酸、二氫鉀、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳和硫酸 鐵，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸銨磷酸、二氫鉀、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳和硫酸鐵 的濃度分別為 10-20g/L、2-10g/L、2-10g/L、1-1.5g/L、1-1.5g/L、0.02-0.048/1和0.02-〇 · 〇4g/L;之后，調節(jié)pH值為6 · 5-7 · 0，在115-121°C下滅菌15-30min，制得發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0034] -個優(yōu)選方案中，所述菌種種子液的培養(yǎng)方法為：
[0035] 8.1)將菌種接種到一級液體培養(yǎng)基中，之后將接種有菌種的一級液體培養(yǎng)基在75 °C水浴lOmin，之后將其至于37°C厭氧培養(yǎng)至一級液體培養(yǎng)基中的菌體生長至0D600 = 0.8 時獲得一級菌液；
[0036] 8.2)將一級菌液轉接至二級液體培養(yǎng)基中37°(：厭氧培養(yǎng)至菌體生長至00600 = 0.2時停止發(fā)酵，獲得菌種種子液；
[0037] 其中，一級液體培養(yǎng)基與二級液體培養(yǎng)基的體積比為1:100。
[0038] -個優(yōu)選方案中，所述一級