一種微生物轉(zhuǎn)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明采用摩根菌轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)D-苯乳酸，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] D-苯乳酸，學(xué)名R-( + )_2-羥基-3-苯基丙酸，英文名為：R-( + )-2-hydroxy_3-phenylpropanoic acid、D-(+)-3_Phenyllactic acid〇
[0003] 苯乳酸是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)可以由部分乳酸菌分泌產(chǎn)生的一種新型生物防腐劑。它有D-苯乳酸和L-苯乳酸兩種對(duì)映異體體，能夠有效抑制多種引起食物腐敗的細(xì)菌及產(chǎn)生毒素的 真菌。研究表明D-苯乳酸的抑菌能力略高于L-苯乳酸。
[0004] 作為一種新型生物防腐劑，苯乳酸在食品工業(yè)中具重要的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前主要通 過(guò)大腸基因工程菌表達(dá)乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生產(chǎn)，如中國(guó)專利CN201410818165.X、 CN201410393768.X和CN201210338378.3。也有通過(guò)各類乳酸菌轉(zhuǎn)化苯丙酮酸或苯丙氨酸生 產(chǎn)，如中國(guó)專利CN201510089823.0、CN201210005544.8等。也有采用芽孢桿菌轉(zhuǎn)化苯丙酮酸 產(chǎn)苯乳酉愛(ài)的方法（Efficient Conversion of Phenylpyruvic Acid to Phenyl lactic Acid by Using Whole Cells of Bacillus coagulans SDM,2011,PLoS One.6(4): el9030)〇
[0005] 基于D-苯乳酸的重要應(yīng)用價(jià)值，本專利提出了采用摩根菌屬微生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨 酸生產(chǎn)D-苯乳酸的方案。L-苯丙氨酸當(dāng)前主要通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，原料豐富易得。
[0006] 摩根菌(Morganella)是一類可使苯丙氨酸氧化脫氨的革蘭氏陰性細(xì)菌?，F(xiàn)有2個(gè) 種和2個(gè)亞種：摩根摩根菌（Morganella morganii )、耐冷摩根菌（Morganella psychrotolerans)、摩根摩根菌摩根亞種（Morganella morganii subsp .morganii)和摩根 摩根菌西伯尼亞種(Morganella morganii subsp.Sibonii subsp·)。摩根菌具有強(qiáng)大的氧 化脫氨能力（Sherris Medical Microbiology，2004,4th ed.)，L_苯丙氨酸可以被摩根菌 氧化脫氨成苯丙酮酸。
[0007] 相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為這些微生物只能將L-苯丙氨酸氧化成苯丙酮酸，而無(wú)法進(jìn)一步還原 成苯乳酸（a-keto acids are novel siderophores in the genera proteus， providencia,and morganella and are produced by amino acid deaminases，1993， Journal of bacteriology，175(9) ,2727-2733)，這可能與之條件選擇不當(dāng)有關(guān)。
[0008] 本發(fā)明可通過(guò)摩根菌屬微生物將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成光學(xué)純的D-苯乳酸。苯丙酮酸 雖然是更為直接的底物，但價(jià)格較高，因此L-苯丙氨酸是最佳的底物。摩根菌是一種兼性厭 氧菌，可以在厭氧條件或好氧條件下轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-苯乳酸，具有高轉(zhuǎn)化率和高純度的特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明通過(guò)培養(yǎng)摩根菌屬微生物菌體，轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)D-苯乳酸，技術(shù)方案 如下：
[0010] 1、菌株
[0011] 本發(fā)明所用的菌株有購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種庫(kù)的Morganella morganii subsp.sibonii ATCC 49948、Morganella morganii subsp.morganii ATCC 25830以及購(gòu) 自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的Morganella morganii CICC 21517和購(gòu)自BCCM/ LMG Bacteria Collection的Morganella psychrotolerans LMG 23374。
[0012] 2、菌體培養(yǎng)
[0013] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:碳源0_50g/L，氮源0-50g/L，磷酸氫二銨0-2g/L，磷酸二 氫鉀〇-lg/L，硫酸鎂〇-〇. 5g/L，硫酸亞鐵〇-〇. 5g/L，氯化納0_5g/L，可調(diào)節(jié)pH至2-8，可也pH 自然;接種量為5-20%，發(fā)酵溫度為20-40°C，發(fā)酵周期為24-72小時(shí)。種子和發(fā)酵均采用此 培養(yǎng)基。
[0014] 用于培養(yǎng)菌種的碳源可以是葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、半乳糖、甘油。培養(yǎng) 用氮源可以是硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿等有機(jī)氮源。碳源和氮 源可以是一種或多種的組合。
[0015] 液態(tài)培養(yǎng)菌體的過(guò)程可以采用厭氧或好氧方式。
[0016] 3、轉(zhuǎn)化產(chǎn)D-苯乳酸
[0017]轉(zhuǎn)化過(guò)程采用的方案有2種：
[0018] (1)細(xì)胞的液態(tài)培養(yǎng)過(guò)程，將L-苯丙氨酸底物加入上述的培養(yǎng)體系中；L-苯丙氨酸 添加量為0_20g/L。
[0019] (2)將液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物離心去除發(fā)酵液得到菌體，將菌體放入含有L-苯丙氨酸底 物的水溶液反應(yīng)體系中進(jìn)行;轉(zhuǎn)化過(guò)程溫度20-40 °C，pH 2-8，轉(zhuǎn)化時(shí)間1-24小時(shí)。轉(zhuǎn)化液中 L-苯丙氨酸起始濃度為0. l_20g/L。
[0020] 4、樣品的檢測(cè)分析
[0021]轉(zhuǎn)化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色譜儀檢測(cè)分析，色譜條件為:流 動(dòng)相是甲醇-0.1%甲酸水(40:60)、采用漢邦1^8代8(：18色譜柱(4.6\250111111，54111)，流速 0.6ml/min、柱溫30 °C、進(jìn)樣量20μ1、檢測(cè)器波長(zhǎng)200nm。
[0022]采用江蘇漢邦科技有限公司的DAC-HB50制備色譜柱制備轉(zhuǎn)化樣品，制備色譜條件 為:流動(dòng)相50 %甲醇、柱溫自然、流速3ml/min、進(jìn)樣量5ml。樣品達(dá)到色譜純99.9%，反復(fù)進(jìn) 樣分離得到的產(chǎn)品于50°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸干。稱取制備得到的樣品0.5g，溶于去離子水中并 定容至50ml，采用日本愛(ài)宕AP-300全自動(dòng)旋光儀測(cè)定放光度。進(jìn)一步采Varian Gemini 2000(VnmrS 600MHz，600/54/ASP)分析樣品的核磁數(shù)據(jù)。樣品進(jìn)一步采用UPLC-QT0F-MS法 分析分子量，儀器為Waters MALDI SYNAPT QT0F MS液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例1
[0024]轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析測(cè)定。
[0025]配制培養(yǎng)基如下：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉 Sg/LdOOml三角瓶中裝液量 為100ml，共50瓶，120°C，20分鐘滅菌。取Morganella morganii CICC 21517甘油管種子液 lmL接種，發(fā)酵溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。培養(yǎng)24后，將發(fā)酵液離心（轉(zhuǎn)速lOOOOrpm，時(shí)間 l〇min)，去除上清液獲得菌體，離心獲得的菌體用無(wú)菌水清洗兩遍。取20g濕菌體放入L-苯 丙氨酸濃度為l〇g/L的1000ml溶液中，混合均勻。于37°C搖床振蕩（100rpm)24小時(shí)后，100°C 水浴加熱3分鐘殺滅菌體。再離心(轉(zhuǎn)速lOOOOrpm，時(shí)間lOmin)去除菌體，得到轉(zhuǎn)化后的上清 液。液相分析D-苯乳酸濃度為2. lg/L，剩余L-苯丙氨酸濃度為5.2g/L。采用制備色譜得到 1.3g純品。
[0026] 旋光儀分析其旋光度為[α]|? = +20.0°。核磁數(shù)據(jù)為：1H NMR(CDC13 600ΜΗζ):δ 7.31(2H，d J 7.6Hz)，7.29(lH，d，J 7.6Hz)，7.24(2H，d，J 7.6Hz)，4.491H，dd，J 4.3， 7.3Hz)，4.27(2H，0Hs，broad)，3.21(lH，dd，J 4.3,14.0Hz)，2.96(lH，dd，J 7.3,14.0Hz)〇 13C 匪R(CDC13,600MHz):δ177·57，135·93，129·50，129·54，128·56，128·63，127·13， 71 · 15，40 · 11。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為：（-ESI，negative mode)m/z: 165 · 0[M-1 ]。
[0027] 根據(jù)以上數(shù)據(jù)，確定其分子及光學(xué)結(jié)構(gòu)與D_苯乳酸完全一致。
[0028] 實(shí)施例2
[0029]好氧培養(yǎng)與厭培養(yǎng)的比較。配制培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L，蛋白胨20g/L，磷酸氫二銨 lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.3g/L，硫酸亞鐵0.3g/L;起始pH和發(fā)酵過(guò)程pH均為自然 500ml三角瓶中裝液量為100ml，共2瓶，120°C，20分鐘滅菌。
[0030]取Morganella morganii subsp.sibonii ATCC 49948甘油管種子液lmL接種 1瓶， 于厭氧培養(yǎng)箱中35°C培養(yǎng)72小時(shí)，離心獲得的菌體用無(wú)菌水清洗兩遍。取O.lg濕菌體放入 L-苯丙氨酸濃度為2g/L的4ml溶液中，混合均勻，厭氧培養(yǎng)箱中35°C靜置轉(zhuǎn)化24小時(shí)后，100 °C水浴加熱3分鐘殺滅菌體。再離心(轉(zhuǎn)速1 OOOOrpm，時(shí)間1 Omin)去除菌體，得到轉(zhuǎn)化后的上 清液。