一種用于檢測(cè)綿羊肺腺瘤病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及綿羊肺腺瘤防治技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種用于檢測(cè)綿羊肺腺瘤病毒的 化qman Real-time RT-PCR(探針?lè)▽?shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))試劑盒，本發(fā)明還包括 該試劑盒的使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 綿羊肺腺瘤（Sheep pulmony adenomatosis,SPA)是由外源性D型和B型綿羊肺腺 瘤病毒(Jaagsiekte she邱rehovirus，JSRV)引起一種慢性、進(jìn)行性、接觸性傳染的肺臟 腫瘤性疾病。綿羊肺腺瘤病首次傳入敏感羊群后發(fā)病率達(dá)50%-80%。成年綿羊易感且發(fā)病 后繼發(fā)感染性呼吸道疾病、急劇消瘦，死亡率100%，嚴(yán)重影響著世界范圍內(nèi)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。 SPA主要呈地方性散發(fā)，在英國(guó)、德國(guó)、法國(guó)、荷蘭、意大利、南斯拉夫、希臘、W色列、保加利 亞、±耳其、俄羅斯、南非、秘魯、印度及中國(guó)新疆等地均有該病的發(fā)生和流行，特別是在蘇 格蘭SPA呈頑固的地方性散發(fā)，年發(fā)病率為20%左右，死亡率很高，可達(dá)100%。故世界動(dòng)物 衛(wèi)生組織將其列為B類傳染病。
[0003] 自然發(fā)病的SPA病羊肺腫瘤勻漿或肺液濃縮后經(jīng)氣管內(nèi)接種新生黑羊，可迅速引 起腫瘤。最快出現(xiàn)臨診癥狀的病羊在3-6周。當(dāng)SPA反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入呼吸系統(tǒng)后，在依賴RNA 的DNA反轉(zhuǎn)錄酶作用下，WSPA反轉(zhuǎn)錄病毒的RNA為模板，合成DNA，然后結(jié)合到感染羊的細(xì)胞 DNA中，使羊支氣管上皮細(xì)胞增殖加快，形成小的腺瘤。經(jīng)過(guò)緩慢的發(fā)展，小的腺瘤灶逐漸擴(kuò) 展和融合，充滿肺泡腔及細(xì)支氣管，使肺泡的正常氣體交換發(fā)生障礙，最后使部分病肺失去 作用。如果并發(fā)細(xì)菌性肺炎或綿羊進(jìn)行性肺炎，則加速病羊的死亡。至今為止，在感染羊的 循環(huán)血液中檢測(cè)不到相應(yīng)抗體，許多生物學(xué)家認(rèn)為SPA相似于人類的免疫缺陷病。因此，急 需建立一種可W準(zhǔn)確診斷綿羊肺腺瘤病毒的敏感、特異、重復(fù)性好的檢測(cè)方法。目前，用于 檢測(cè)綿羊肺腺瘤的方法有多種，如臨床癥狀初步診斷法、鏡檢診斷法、免疫學(xué)診斷法(包括 免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法）、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)(常規(guī)PCR、RT-PCR技術(shù)、套式PCR技術(shù)） 等。但是運(yùn)些方法都存在或操作復(fù)雜或敏感性低或漏檢、假陽(yáng)性等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)不能適應(yīng)準(zhǔn)確、快速和敏感的檢測(cè)需 求，從而提供一種用于能夠快速、敏感、準(zhǔn)確地檢測(cè)綿羊肺腺瘤病毒的化qman Real-time RT-PC時(shí)式劑盒，本發(fā)明還提供該試劑盒的使用方法。本試劑盒及使用方法還適用于檢測(cè)低 微含量的綿羊肺腺瘤病毒。
[000引為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案：
[0006] 一種用于檢測(cè)綿羊肺腺瘤病毒的化qman Real-time RT-PCR試劑盒，所述試劑盒 包含One Step RT-PCR buffer、酶混合物、陽(yáng)性對(duì)照、無(wú) RNA酶水、序列SEQ ID NO=^PSEQ ID NO:2的引物及SEQ ID NO:3的探針引物的混合物。
[0007] 所述序列沈Q ID NO:1至沈Q ID NO:2的引物混合物包括：
[000引沈Q ID NO: 1:上游引物
[0009] 沈Q ID NO:2:下游引物
[0010] 探針引物序列為：
[0012] 所述探針引物的5 '端標(biāo)記物為FAM報(bào)告巧光基團(tuán)、3 '端標(biāo)記物為T(mén)AMRA澤滅巧光基 團(tuán)。
[0013] 沈Q ID N0:1 至沈Q ID N0:2的由5'端向3'端延長(zhǎng)的序列：SEQ ID N0:4(327bp):
[001引所述陰性對(duì)照為無(wú) RNA酶水。
[0016] 所述陽(yáng)性對(duì)照為含有綿羊肺腺瘤基因序列的陽(yáng)性質(zhì)粒pGM-JSRV，其構(gòu)建方式如 下：
[0017] a.綿羊肺腺瘤基因組RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。W 提取的病毒RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。WSEQ ID NO: 1及SEQ ID NO:2作為引物擴(kuò)增， 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性5〇3,60°(：退火5〇3,72°(：延伸5〇3，共35個(gè)循環(huán);721： 再延伸8m i n，4 °C 5m i n。PCR產(chǎn)物于1 Og/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[001引b. PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析
[0019] PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含lOOmg/L氨節(jié)青霉素的LB平板上， 37°C培養(yǎng)12~16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用質(zhì)粒(小量)提取試劑盒提取質(zhì)粒，將序列測(cè)定正確 的質(zhì)粒命名pGM-JSRV，應(yīng)用化no化OP2000核酸蛋白分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為411ng/ul， 計(jì)算出其拷貝數(shù)為1.28xl〇ii(copies/ul，拷貝數(shù)/微升），本發(fā)明的試劑盒利用1.28X10 7 (COPiesM)濃度的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照W及利用其倍比稀釋后制作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]所述試劑盒用于檢測(cè)綿羊肺腺瘤病毒的使用方法，包括W下步驟：
[0021 ]實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR，反應(yīng)體系如下：
[0022] a.One Step RT-PCR buffer: 12.5份；
[0023] b.引物濃度均為IOpmolAil的S條引物混合液3份，其中上游引物1份，下游引物I 份，探針引物1份；
[0024] C.酶混合物1份；
[002引 （1.無(wú)1?酷/0臟酶水5.5份；
[0026] e.提取樣品的RNA模板3份；
[0027] f.陽(yáng)性對(duì)照pGM-JSRV陽(yáng)性質(zhì)粒3份；
[002引 g.陰性對(duì)照無(wú) DNA酶水3份。
[0029]實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR，擴(kuò)增條件如下：
[0030] 42°C 反轉(zhuǎn)錄 5min;94°C 預(yù)變性 2min;94°C20s，退火溫度 6〇1：3〇3,721：2〇3,40個(gè)循 環(huán)。
[0031] 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)為：
[0032] 在NTC沒(méi)有Ct值的情況下，Ct值<35判為陽(yáng)性;Ct值介于35-40為可疑，需重復(fù)檢測(cè)。 再次測(cè)定時(shí)該樣品Ct值<35為陽(yáng)性，Ct值含35為陰性。也可W依擴(kuò)增得到的Ct值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0033] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了特異性針對(duì)綿羊肺腺瘤病毒的引物及探針，旨在建立一種可W快 速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)我國(guó)綿羊肺腺瘤病毒的巧光定量RT-PCR方法，優(yōu)化并組裝成試劑盒。 該方法的建立對(duì)臨床診斷綿羊肺腺瘤病毒及其流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。與普通RT-PCR 方法相比，本發(fā)明省時(shí)、省力，成本較低。本發(fā)明在檢測(cè)過(guò)程中將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過(guò)程在一 步反應(yīng)中完成，使得檢測(cè)時(shí)間由原來(lái)的4-5小時(shí)縮短到現(xiàn)在的1-2小時(shí)，從而有利于快速檢 。并且比普通PCR的靈敏度高，對(duì)模板濃度要求較低，可用于檢測(cè)低微含量的綿羊肺腺瘤 病毒;無(wú)需電泳就可直觀的反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果，避免了漠化乙錠對(duì)人體健康的危害;本發(fā)明使用 了探針?lè)?，只有探針引物特異的結(jié)合到擴(kuò)增的祀序列上時(shí)才會(huì)產(chǎn)生有效的結(jié)果，巧光定量 可W看到整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程、擴(kuò)增效率、溶解溫度，而且利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品直接得到 標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)，進(jìn)行 精確定量。因此具有高度特異、敏感、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。與普通PCR方法相比，本發(fā)明具有更 高的準(zhǔn)確性，有助于綿羊肺腺瘤的防控和隱性帶毒動(dòng)物的剔除，避免造成大范圍的傳染。本 發(fā)明試劑盒及其使用方法適用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級(jí)防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖 場(chǎng)等，具有較好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1為本發(fā)明制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0035] 圖2為本發(fā)明樣本檢測(cè)圖。
[0036] 圖1中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)敘述 [003引 實(shí)施例1
[0039] 1、引物的設(shè)計(jì)和制備
[0040] 參照GenBank(基因庫(kù))查找十株毒株，經(jīng)序列比對(duì)尋找每個(gè)序列上均保守的區(qū)域， 選取保守區(qū)域并設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，一條探針引物，序列如下：
[00川擴(kuò)增引物序列為：
[0042] 沈Q ID NO: 1:上游引物（
[0043] 沈Q ID NO:2:下游引物（
[0044] 探針引物序列為：
上述引物由大連寶生物工 程有限公司合成并進(jìn)行標(biāo)記。
[0046]陽(yáng)性對(duì)照:本發(fā)明試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所構(gòu)建并 保存。
[0047] 2、制作陽(yáng)性對(duì)照及其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0048] 陽(yáng)性對(duì)照為含有綿羊肺腺瘤基因序列的陽(yáng)性質(zhì)粒pGM-JSRV，其構(gòu)建方式如下：
[0049] a.綿羊肺腺瘤基因組RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。W 提取的病毒RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。WSEQ ID NO: 1及SEQ ID NO:2作為引物擴(kuò)增， 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性5〇3,60°(：退火5〇3,72°(：延伸5〇3，共35個(gè)循環(huán);721： 再延伸8m i n，4 °C 5m i n。PCR產(chǎn)物于1 Og/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[0050] b. PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析
[0051 ] PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含lOOmg/L氨節(jié)青霉素的LB平板上， 37°C培養(yǎng)12~16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用質(zhì)粒(小量)提取試劑盒提取質(zhì)粒，將序列測(cè)定正確 的質(zhì)粒命名pGM-JSRV，應(yīng)用化no化OP2000核酸蛋白分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為411ng/ul， 并計(jì)算出拷貝數(shù)為1.28xl〇ii(copies/ul，拷貝數(shù)/微升），將其10倍倍比稀釋后按照標(biāo)準(zhǔn)曲 線制作程序制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依標(biāo)準(zhǔn)曲線將1.28xl0 7k〇pies/ul)濃度的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0052] 3、制備用于檢測(cè)10頭份的試劑盒
[0053] 本試劑盒由W下組分組成：
[0054] a.One Step RT-PCR buffer: 12化1;
[005引 b.引物濃度均為I化mol AU的S條引物混合液3化I，其中上游引物IOiil，下游引物 1化1，探針引物IOiU;
[0056] C.酶混合物 IOiil;
[0057] d.無(wú) RNA/DNA 酶水 10化1;
[005引 e.陽(yáng)性對(duì)照pGM-180陽(yáng)性質(zhì)粒30iU。
[0059] 4、用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)綿羊肺腺瘤病毒
[0060] (I)PCR總體系為25山。分別將本發(fā)明試劑盒中One step RT-PCR buffer: 12.5山、 S條引物共化I、酶混合物Iiil、無(wú) RNA/DNA酶水5 .扣I、提取樣品的RNA模板化I、陽(yáng)性對(duì)照 pGM-JSRV陽(yáng)性質(zhì)粒化1、陰性對(duì)照無(wú) DNA酶水化1，加入到0.2ml擴(kuò)增管中。
[0061] (2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽(yáng)性對(duì)照化1、從綿羊肺腺瘤感染羊肺臟組織中提取 R