基于its序列位點(diǎn)的鑒別桃仁與苦杏仁的pcr方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種基于ITS序列位點(diǎn)的鑒別桃仁與苦杏仁 的PCR方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 桃仁為菩薇科植物桃Prunus persica化.）Batsch或山桃P.davidiana(Ca;r;r.) Franch.的干燥成熟種子，具有活血桂疲、潤腸通便、止咳平喘的功效。用于經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘤 瘡塊、肺癡腸癡、跌撲損傷、腸燥便秘、咳嗽氣喘等癥的治療?？嘈尤蕿槠修笨仆瑢僦参锷叫?P. armeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯矛U亞杏 P. sibirica L.、東北杏 P.mandshurica (MaxinOKoehne、或杏P.armeniaca L.的干燥成熟種子。桃仁與苦杏仁在外觀上非常相似， 經(jīng)脫皮、炮制加工后更難區(qū)分，但二者功效不同，桃仁主用于活血化疲，而苦杏仁為止咳平 喘藥。由于桃仁貨源較少，價錢較貴，市場上常滲W苦杏仁混充出售。苦杏仁中苦杏仁巧含 量較高，苦杏仁巧會釋放出含氯的有毒物質(zhì)，具有較大毒性，混用容易引起潛在的用藥風(fēng) 險。因此，建立一種快速、簡易、準(zhǔn)確鑒定桃仁和苦杏仁及其近緣種的分子鑒定體系，對于控 制桃仁的藥材質(zhì)量W及用藥安全都具有十分重要的意義。
[0003] 由于科技的飛速發(fā)展，分子鑒定技術(shù)逐漸應(yīng)用于中藥鑒定中來。林韻涵等利用DNA 條形碼技術(shù)，通過序列拼接，數(shù)據(jù)處理，NJ樹構(gòu)建等方法對藥材桃仁及其近緣種進(jìn)行口 S2分 子鑒定，結(jié)果顯示桃種內(nèi)變異位點(diǎn)為6個，山桃為3個，種內(nèi)平均K2P距離均為0.009,種間平 均K2P距離為0.021，說明桃仁藥材的口 S2序列變異小，較為保守和穩(wěn)定。桃仁藥材的兩個基 原物種的種內(nèi)平均K2P距離（0.009)小于其與近緣種的種間平均遺傳距離（0.037)。表明 口 S2序列作為DNA條形碼可W有效地鑒定藥材桃仁及其近緣種。而特異性PCR技術(shù)是一種錯 配擴(kuò)增突變分析技術(shù)，是根據(jù)正品、偽品藥材特定區(qū)域的DNA序列，設(shè)計有高度特異性的正 品鑒別引物，此引物能有效擴(kuò)增來自正品藥材DNA模板中的特定區(qū)域。鑒定樣品時，用鑒別 引物對所提取樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增經(jīng)凝膠電泳檢測鑒別樣品真?zhèn)?。特異性PCR技術(shù)具有 W下優(yōu)勢:操作簡單、成本低、重復(fù)性好;使用特異性引物可極大地降低PCR假陽性率，保證 鑒定的準(zhǔn)確性;對DNA質(zhì)量要求不高，所需的DNA量少;PCR鑒定條帶單一，真?zhèn)嗡幉呐卸?biāo)準(zhǔn) 簡單可靠，無需進(jìn)行測序及軟件分析。特別是近年來快速PCR技術(shù)迅速發(fā)展，使得中藥材分 子鑒定在現(xiàn)場快速鑒定上的應(yīng)用成為了可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種鑒別桃仁或苦杏仁的引物。
[000引本發(fā)明提供的引物，能擴(kuò)增出DNA片段A的引物對；
[0006] 所述DNA片段A是W桃仁為模板，用序列1和序列2所示引物對進(jìn)行擴(kuò)增得到的產(chǎn) 物。
[0007] 實(shí)際應(yīng)用中，可能因為模板的不同，擴(kuò)出的產(chǎn)物存在個別堿基或幾個堿基的差異， 但運(yùn)都屬于DNA片段A的范疇。
[0008] 上述引物中，所述引物對由引物I和引物2組成；
[0009] 所述引物1為如下1)或2):
[0010] 1)為序列1所示的單鏈DNA分子；
[0011] 2)為序列1刪除和/或增加和/或改變一個或幾個核巧酸得到的單鏈DNA分子；
[0012] 所述引物2為如下3)或4):
[OOU] 3)為序列2所示的單鏈DNA分子；
[0014] 4)為序列2刪除和/或增加和/或改變一個或幾個核巧酸得到的單鏈DNA分子。
[001引上述引物中，所述引物1和所述引物2的摩爾比化：1。
[0016]本發(fā)明另一個目的是提供一種用于鑒別或輔助鑒別桃仁或苦杏仁的PC時式劑。 [0017]本發(fā)明提供的PC時式劑，包括上述的引物；
[001引所述引物中每條引物在所述PCR試劑中的終濃度均為0.2曲101 ? [1。
[0019] 本發(fā)明第=個目的是提供一種鑒別或輔助鑒別桃仁或苦杏仁的試劑盒。
[0020] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物或上述的PC時式劑。
[0021] 上述的引物或上述的PC時式劑或權(quán)利要求5所述的試劑盒在如下(Al)或(A2)中的 應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍：
[0022] (Al)鑒別或輔助鑒別桃仁或苦杏仁；
[0023] (A2)鑒定或輔助鑒定待測樣品是桃仁或苦杏仁。
[0024] 本發(fā)明第四個目的是提供一種鑒別或輔助鑒別桃仁或苦杏仁的方法。
[0025] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:檢測待測樣品中是否含有DNA片段A;如果含 有，則待測樣品為或候選為桃仁;如果不含有，則待測樣品為或候選為苦杏仁；
[0026] 所述DNA片段A是W桃仁為模板，用序列1和序列2所示引物對進(jìn)行擴(kuò)增得到的產(chǎn) 物。
[0027] 上述方法中，所述檢測待測樣品中是否含有DNA片段A的方法包括如下步驟:用上 述的引物對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段A。
[0028] 上述方法中，所述DNA片段A的大小為300-35化P。
[0029] 上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的模板為待測樣品的基因組DNA;
[0030] 所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為55°C-63°C。
[0031] 本發(fā)明的實(shí)驗證明，通過引物篩選與條件優(yōu)化，確定引物G4-7可將桃仁與苦杏仁 鑒別開，且其靈敏度高，穩(wěn)定性好，可用于桃仁與苦杏仁的分子鑒別。相比于傳統(tǒng)鑒別，其可 信度較高，可用于桃仁藥材分子鑒定的推廣與應(yīng)用，且為桃仁藥材的快速現(xiàn)場鑒別提供了 依據(jù)。
【附圖說明】
[0032] 圖1為桃仁與苦杏仁樣品性狀圖。
[0033] 圖2為桃仁與杏仁口 S2與G4-7的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0034] 圖3為基于口 S2序列構(gòu)建的桃仁與杏仁藥材的鄰接(NJ)樹。
[0035] 圖4為DNA模板濃度優(yōu)化結(jié)果。
[0036] 圖5為退火溫度考查結(jié)果。
[0037] 圖6為不同酶考查結(jié)果。
[003引圖7為不同PCR儀考查結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041 ] PCR儀（Veriti ,GE肥）；PCR儀（6325YM00261，E郵endow AG);微量核酸定量儀 (N02000C，GE肥）；臺式離屯、機(jī)（SIGMA);離屯、機(jī)（SCIL0GEX D1008JKA MS3basic);縱滿混勻 儀(SCIL0GEX MX-E);電熱恒溫水浴鍋(DK-S220);高級巧光化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(FUSION-化）；電 腦S恒多用電泳儀(DYY-12,北京六一儀器廠）。
[0042] 植物基因組DNA提取試劑盒（離屯、柱型DP305-2TIANGEN) ;2 XEasyTaq PCR SuperMix(TRAN) ;2XTaq PCR StarMix(A112GenStar);Ex Taq DNA聚合酶（RR53AM TakaRa) ;Phusion超保真PCR Master Mix(M0531,BioLaba) ;2K DNA Marker化110，TRAN); 5K DNA Marker(Elio,TRAN)；6XDNA Loading Buffer(D026,TRAN)；10000XGeneGreen Nucleic Dye(RT210，TIAN陽N)，瓊脂糖(G-10，BI0WEST)，其他試劑均為分析純。
[0043] 選取于河北安國藥材市場購買，產(chǎn)于西藏、四川阿巧、河北安國、山西荷花池等地 的8份桃仁，4份苦杏仁。實(shí)驗材料信息見表1，部分樣品性狀見圖1。
[0044] 表1實(shí)驗材料
[0047]實(shí)施例1、鑒別桃仁或苦杏仁的引物設(shè)計及合成
[004引取桃仁與苦杏仁約lOOmg，經(jīng)粉碎后，采用植物DNA提取試劑盒提取各藥材總DNA， 用50化無菌水溶解。用通用引物口 S2F和口 S3RW高保真酶擴(kuò)增樣品DNA并進(jìn)行雙向測序。基 于ITS2序列，利用MEGA6通過鄰接法(NJ)所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹圖（圖3)表明，桃仁與苦杏仁 序列分別聚集成枝。表明ITS2序列能把桃仁藥材與苦杏仁藥材明顯區(qū)分開。
[0049] 將所測得的序列與GenBank中的桃仁與杏仁ITS序列用BioEdit軟件進(jìn)行比對分 析，找出具有穩(wěn)定差異的特異性片段，篩選獲得變異位點(diǎn)，通過該位點(diǎn)運(yùn)用Premie巧rimer 5.0軟件針對桃仁的特異性片段設(shè)計多對鑒別引物，設(shè)計的特異引物擴(kuò)增后的片段大小