一種單通道下檢測(cè)bcr/abl基因融合的探針標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種巧光原位雜交探針的標(biāo)記方法和檢測(cè) 試劑盒，通過使用巧光原位雜交的手段，檢測(cè)樣品中的樣本基因組中的BCR/A化基因融合。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是起源于多能造血干細(xì)胞的惡性血液病，9和22號(hào)染色體 易位形成的BCR/ABL融合基因是確診和療效判斷的重要依據(jù)。BCR/A化分別定位于22號(hào)染色 體及9號(hào)染色體，BCR/A化融合基因是一種抗細(xì)胞調(diào)亡的基因，其表達(dá)產(chǎn)物通過抗細(xì)胞調(diào)亡 作用而使細(xì)胞調(diào)控發(fā)生素亂。95%的CML病人會(huì)有此融合基因，并且，該融合基因所表達(dá)的 蛋白既是祀向治療藥物甲橫酸伊馬替尼的作用目標(biāo)。所W，檢測(cè)白血病病人外周血或骨髓 的BCR/A化融合基因顯得尤為重要。
[0003] 與其它檢測(cè)方法相比，巧光原位雜交(FISH)特有的準(zhǔn)確性和直觀性使其成為檢測(cè) BCR/A化融合基因的金標(biāo)準(zhǔn)。但傳統(tǒng)的FISH試劑盒使用常規(guī)的有機(jī)巧光染料來進(jìn)行探針標(biāo) 記，難W克服兩個(gè)弱點(diǎn)：
[0004] 1)有機(jī)巧光染料(如切3，F(xiàn)AM等)巧光強(qiáng)度較弱，必須W較大的基因組DNA片段為模 板標(biāo)記探針，才能檢測(cè)到較強(qiáng)的巧光信號(hào)。WBCR/A化基因檢測(cè)為例，傳統(tǒng)的FISH探針必須 分別WBCR、A化兩個(gè)基因附近600kB的基因組DNA片段為模板進(jìn)行標(biāo)記，才能得到較為理想 的巧光信號(hào)。但由于600kB的DNA片段太大，不得不拆分成IOOkB左右的亞克隆進(jìn)行保存。從 而每次探針標(biāo)記都必須對(duì)10余個(gè)亞克隆進(jìn)行分別標(biāo)記，大大增加了 BCR/A化融合基因檢測(cè) 試劑盒的生產(chǎn)難度，從而提高了生產(chǎn)成本。
[0005] 2)不同顏色的有機(jī)巧光染料，有不同的激發(fā)波長(zhǎng)，如切3在548nm波長(zhǎng)激發(fā)光下發(fā) 出紅色巧光，F(xiàn)AM在492nm波長(zhǎng)激發(fā)光下發(fā)出綠色巧光，而染細(xì)胞核的DAPI在340nm波長(zhǎng)激發(fā) 光下發(fā)出藍(lán)色巧光。故而FI細(xì)檢測(cè)結(jié)果中，代表BCR基因的紅色巧光和代表A化基因的綠色 巧光無法在同一巧光通道下出現(xiàn)，不能直接通過肉眼觀察判斷紅綠巧光信號(hào)是否有重合， 良陽(yáng)CR/A化基因是否有融合，只能在紅/綠巧光通道下分別拍照，通過圖像分析軟件處理后 再加 W判斷，檢測(cè)效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] -方面，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了量子點(diǎn)巧光染 料在檢測(cè)BCR/A化基因融合的探針中的應(yīng)用。
[0007] 優(yōu)選地，所述量子點(diǎn)巧光染料為CdSe/ZnS和CdTe/ZnS;所述檢測(cè)BCR/A化基因融合 的探針包括檢測(cè)BCR基因的探針和檢測(cè)A化基因的探針，更優(yōu)選地，所述CdSe/ZnS和CdTe/ ZnS分別標(biāo)記在檢測(cè)BCR基因的探針和檢測(cè)A化基因的探針上。
[000引在上述技術(shù)方案中，在檢測(cè)BCR/A化基因融合的探針的標(biāo)記過程中使用量子點(diǎn)巧 光染料CdSe/ZnS和CdTe/ZnS替代傳統(tǒng)巧光染料，使得標(biāo)記完成后的BCR探針在激發(fā)光下發(fā) 出紅色巧光，巧光基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)為570nm;而探針在同一波長(zhǎng)單色激發(fā) 光下發(fā)出綠色巧光，巧光基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)為340nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510nm。
[0009] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)BCR基因的探針的標(biāo)記方法，用核酸探針標(biāo)記 方法對(duì)BCR基因進(jìn)行探針標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)使用的模板序列為人染色體22qll.21~22qll.26區(qū)， 使用的巧光染料為量子點(diǎn)巧光染料。
[0010] 優(yōu)選地，所述量子點(diǎn)巧光染料為CdSe/ZnS。
[0011] 所述核酸探針標(biāo)記方法可為現(xiàn)有技術(shù)中常用的核酸探針標(biāo)記方法，優(yōu)選地，所述 核酸探針標(biāo)記方法為缺口平移法、隨機(jī)引物法或PCR法。
[0012] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)基因的探針的標(biāo)記方法，用核酸探針標(biāo)記 方法對(duì)基因進(jìn)行探針標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)使用的模板序列為人染色體9q34.62~9q34.78區(qū)，使 用的巧光染料為量子點(diǎn)巧光染料。
[0013] 優(yōu)選地，所述量子點(diǎn)巧光染料C肌e/ZnS。
[0014] 所述核酸探針標(biāo)記方法可為現(xiàn)有技術(shù)中常用的核酸探針標(biāo)記方法，優(yōu)選地，所述 核酸探針標(biāo)記方法為缺口平移法、隨機(jī)引物法或PCR法。
[0015] 又一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)BCR/A化基因融合的探針的標(biāo)記方法，所述檢 測(cè)BCR/A化基因融合的探針包括檢測(cè)BCR基因的探針和檢測(cè)A化基因的探針，用核酸探針標(biāo) 記方法對(duì)分別對(duì)BCR基因和A化基因進(jìn)行探針標(biāo)記，檢測(cè)BCR基因的探針標(biāo)記時(shí)使用的模板 為人染色體22ql 1.21~22ql 1.26區(qū)，檢測(cè)基因的探針標(biāo)記時(shí)使用的模板為人染色體 9q34.62~9q34.78區(qū)，檢測(cè)BCR基因的探針與檢巧UA化基因的探針使用的巧光染料為兩種不 同的量子點(diǎn)巧光染料，兩種量子點(diǎn)巧光染料在同一波長(zhǎng)的單色激發(fā)光下發(fā)出不同顏色的巧 光。
[0016] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)BCR基因的探針使用的量子點(diǎn)巧光染料為CdSe/ZnS，所述檢測(cè) A化基因的探針使用的量子點(diǎn)巧光染料為CdTe/ZnS。
[0017] 所述核酸探針標(biāo)記方法可為現(xiàn)有技術(shù)中常用的核酸探針標(biāo)記方法，優(yōu)選地，所述 核酸探針標(biāo)記方法為缺口平移法、隨機(jī)引物法或PCR法。
[0018] 本發(fā)明還提供了根據(jù)所述的檢測(cè)BCR/A化基因融合的探針的標(biāo)記方法制得的檢測(cè) BCR/A化基因融合的探針。
[0019] 巧光原位雜交技術(shù)進(jìn)行探針標(biāo)記時(shí)，為了得到較為理想的巧光信號(hào)強(qiáng)度，通常需 要使用非常大的基因組DNA片段作為標(biāo)記的模板，如傳統(tǒng)的FISH探針通常選用BCR、A化兩個(gè) 基因附近600kB的基因組DNA片段為模板。如此之大的DNA片段無法保存到一個(gè)克隆中，只能 拆分成多個(gè)克隆進(jìn)行保存和后續(xù)的探針標(biāo)記，大大增加了 BCR/A化融合基因檢測(cè)試劑盒的 生產(chǎn)難度和生產(chǎn)成本。由于量子點(diǎn)巧光染料(CdSe/化S、CdTe/ZnS)的巧光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于有 機(jī)巧光染料(切3，F(xiàn)AM等），所W選用較小的基因組DNA片段作為模板進(jìn)行探針標(biāo)記亦能得到 較為理想的效果。本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)，將最適的區(qū)域定位為BCR模板:人染色體22qll. 21 ~22ql 1.23區(qū);A化模板:人染色體9q34.62~9q34.68區(qū)。兩個(gè)模板區(qū)域均不超過60kB大小， 僅為常規(guī)BCR/ABL FISH檢測(cè)試劑盒模板區(qū)域的1/10,大大降低的生產(chǎn)難度，并提高了產(chǎn)品 的穩(wěn)定性。
[0020] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)BCR/A化基因融合的試劑盒，包括所述的檢測(cè) BCR/A化基因融合的探針。
[0021 ]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括雜交液和洗涂液；
[0022] 其中，所述雜交液包含lO-lOOmmol/L化Cl、10-50mmol/L構(gòu)祿酸鋼、5-20%硫酸葡 聚糖、20-50%去離子甲酯胺、0.01-0.1 %琉基丙酸、0.1-1 %牛血清白蛋白W及0.1-1 %娃 魚精DNA，雜交液的抑值為6-10;
[0023] 所述洗涂液包含lO-lOOmmol/L 化Cl、10-50mmol/L構(gòu)祿酸鋼、0.0 l-0.2%十二燒 基硫酸鋼，洗涂液pH值為6-10。
[0024] 所述探針的濃度為1-lOnmol/L。
[0025] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了利用所述的試劑盒檢測(cè)BCR/A化基因融合的方法，其 特征在于:包括W下步驟：
[0026] 1)向待測(cè)樣本中加入所述雜交液和探針；
[0027] 2)將加有雜交液和探針的待測(cè)樣本在90-95°C變性5~10分鐘后，于40~45°C恒溫 雜交10-16小時(shí)；
[0028] 3)洗涂、封片后，通過巧光顯微鏡在單通道下觀察顯色結(jié)果。
[0029] 當(dāng)所述檢測(cè)BCR基因的探針使用的量子點(diǎn)巧光染料為CdSe/ZnS，所述檢測(cè)A化基因 的探針使用的量子點(diǎn)巧光染料為CdTe/ZnS時(shí)，在巧光顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色巧光，BCR基因 呈紅色巧光，A化基因呈綠色巧光，如BCR/A化基因發(fā)生融合，則呈黃色巧光。
[0030] 優(yōu)選地，利用所述的試劑盒檢測(cè)BCR/A化基因融合的方法，具體包括W下步驟：
[0031] (1)將待檢樣品固定在載玻片上；
[0032] (2)如待檢樣本為細(xì)胞，直接進(jìn)入步驟(3)，如待檢樣本為石蠟切片，則按標(biāo)準(zhǔn)脫蠟 步驟進(jìn)行脫蠟后進(jìn)入步驟(3);
[0033] (3)在樣品上加入10化雜交液，和化L所述的探針，濃度為1-lOnmol/L，蓋上蓋玻 片，并用膠密封玻片四周，W防止雜交液蒸發(fā)；
[0034] (4)將玻片放置在雜交儀中，90-95°C變性5分鐘后，42°C恒溫雜交10-16小時(shí)；
[0035] (5)移去蓋玻片，將載玻片放入預(yù)熱到60-68°C的洗涂液中，恒溫洗涂2次，每次15 分鐘；
[0036] (6)烘干玻片，滴加含1-lOmmol/L DAPI的封片劑進(jìn)行封片，巧光顯微鏡下100倍目 鏡，340皿激發(fā)通道進(jìn)行觀察;在巧光顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色巧光，BCR基因呈紅色巧光，A化 基因呈綠色巧光，如BCR/A化基因發(fā)生融合，則呈黃色巧光。
[0037] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0038] 本發(fā)明使用量子點(diǎn)巧光染料對(duì)BCR和A化兩個(gè)基因進(jìn)行巧光標(biāo)記，使其在同一波長(zhǎng) 激發(fā)光下分別發(fā)出不同的巧光，使用FISH檢測(cè)時(shí)可在一個(gè)巧光通道中觀察，從而提高檢測(cè) 效率。特別是利用CdSe/ZnS和CdTe/ZnS分別對(duì)BCR和A化兩個(gè)基因進(jìn)行巧光標(biāo)記，使其在 34化m波長(zhǎng)激發(fā)光下，分別發(fā)出紅色巧光和綠色巧光，當(dāng)兩個(gè)基因發(fā)生融合時(shí)，紅色巧光和 綠色巧光信號(hào)重疊而呈現(xiàn)出黃色巧光信號(hào)，大大提高了檢測(cè)效率。
[0039] 本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)，將最適的區(qū)域定位為BCR模板：人染色體22qll.21~ 22ql 1.23區(qū);A化模板:人染色體9q34.62~9q34.68區(qū)。兩個(gè)模板區(qū)域均不超過60kB大小，僅 為常規(guī)BCR/ABL FISH檢測(cè)試劑盒模板區(qū)域的1/10,大大降低的生產(chǎn)難度，并提高了產(chǎn)品的 穩(wěn)定性。
【附圖說明】
[0040]圖I為常規(guī)有機(jī)巧光基團(tuán)標(biāo)記BCR/A化探針的檢測(cè)結(jié)果；
[0041 ]圖2為本發(fā)明量子點(diǎn)巧光染料標(biāo)記BCR/A化探針的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 巧光原位雜交(^Fluorescence In Situ Hybridization,簡(jiǎn)稱FI甜)的基本原理是 用標(biāo)記了巧光的單鏈DNA(探針）和與其互補(bǔ)的DNA(樣本）雜交，通過觀察巧光信號(hào)在細(xì)胞 核，染色體上的位置和數(shù)量來反映相應(yīng)基因的情況。由于其直觀、快速、敏感性高和方便靈 活，在癌癥，遺傳，血液學(xué)的診斷中越來越得到廣泛應(yīng)用是多種腫瘤和血液病臨床檢測(cè)的金 標(biāo)準(zhǔn)。
[0043] FISH技術(shù)的特點(diǎn)是可W使用多色巧光對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行標(biāo)記和檢測(cè)，但缺點(diǎn)是每種 顏色的巧光都必須用在其特定的巧光通道下，用特定波長(zhǎng)的激發(fā)光源進(jìn)行激發(fā)，故而每增 加一種顏色的巧光標(biāo)記，就必須在巧光顯微鏡下增加一種巧光通道進(jìn)行觀察，增加了檢