量濃度為25yg /ml；
7)取上述步驟4)凍融后的細胞培養(yǎng)液lmL，接種于各細胞瓶中，將細胞瓶置于35°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30min，期間振搖2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
8)在各細胞瓶中分別加入1mlDMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，將細胞瓶繼續(xù)置于上述CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第2代；
9)重復(fù)上述步驟5)_步驟8)，此為盲傳第3代；
10)滅活檢驗方法:
結(jié)果判定:上述步驟中盲傳3代的各瓶細胞(接種禽流感抗原液或細胞培養(yǎng)液的細胞)均無細胞病變出現(xiàn)，則判定為禽流感抗原液滅活完全;各代細胞瓶任何I瓶出現(xiàn)細胞病變，則判定為禽流感抗原液滅活不完全。
[0018]實驗結(jié)果:上述盲傳3代的9瓶細胞瓶中，每瓶細胞均無細胞病變出現(xiàn)，因此可以判定為禽流感抗原液滅活完全。
[0019]實施例2
一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，包括以下步驟:
1)取4瓶T25細胞瓶培養(yǎng)MDCK細胞30h，MDCK細胞生長密度達80%以上時，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞瓶4次；
2)向各細胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，室溫放置20min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為50yg /ml；
3)將滅活后的禽流感抗原液做10倍稀釋后，各取1.5mL分別接種于各個細胞瓶中，將細胞瓶置于35°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育35min，使滅活后的禽流感抗原液在MDCK細胞上吸附，期間振搖I次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
4)吸附后，在各細胞瓶中分別加入8mlDMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，將細胞瓶繼續(xù)置于上述CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第I代；
5)取4瓶已生長30h，并且生長密度達80%以上的MDCK細胞，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞瓶4次；
6)向各細胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，室溫放置20min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為50yg /ml；
7)取上述步驟4)凍融后的細胞培養(yǎng)液1.5mL，接種于各細胞瓶中，將細胞瓶置于35°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育35min，期間振搖I次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
8)在各細胞瓶中分別加入8-10mlDMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，將細胞瓶繼續(xù)置于上述0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第2代；
9)重復(fù)上述步驟5)-步驟8)，此為盲傳第3代；
10)滅活檢驗方法:
結(jié)果判定:上述步驟中盲傳3代的各瓶細胞(接種禽流感抗原液或細胞培養(yǎng)液的細胞)均無細胞病變出現(xiàn)，則判定為禽流感抗原液滅活完全;各代細胞瓶任何I瓶出現(xiàn)細胞病變，則判定為禽流感抗原液滅活不完全。
[0020]實驗結(jié)果:上述盲傳3代的12瓶細胞瓶中，每瓶細胞均無細胞病變出現(xiàn)，因此可以判定為禽流感抗原液滅活完全。
[0021]實施例3
一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，包括以下步驟:
1)取3瓶T25細胞瓶培養(yǎng)MDCK細胞28h，MDCK細胞生長密度達80%以上時，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞瓶3-次；
2)向各細胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，室溫放置15miη，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為35yg /ml；
3)將滅活后的禽流感抗原液做10倍稀釋后，各取ImL分別接種于各個細胞瓶中，將細胞瓶置于35°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30min，使滅活后的禽流感抗原液在MDCK細胞上吸附，期間振搖2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
4)吸附后，在各細胞瓶中分別加入8mlDMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，將細胞瓶繼續(xù)置于上述CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第I代；
5)取3瓶已生長28h，并且生長密度達80%以上的MDCK細胞，棄去生長液，用0.01mol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞瓶3次；
6)向各細胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，室溫放置15min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為35yg /ml；
7)取上述步驟4)凍融后的細胞培養(yǎng)液lmL，接種于各細胞瓶中，將細胞瓶置于35°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30min，期間振搖2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
8)在各細胞瓶中分別加入8-10mlDMEM培養(yǎng)液，將細胞瓶繼續(xù)置于上述CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第2代；
9)重復(fù)上述步驟5)-步驟8)，此為盲傳第3代；
10)滅活檢驗方法:
結(jié)果判定:上述步驟中盲傳3代的各瓶細胞(接種禽流感抗原液或細胞培養(yǎng)液的細胞)均無細胞病變出現(xiàn)，則判定為禽流感抗原液滅活完全;各代細胞瓶任何I瓶出現(xiàn)細胞病變，則判定為禽流感抗原液滅活不完全。
[0022]實驗結(jié)果:上述盲傳3代的9瓶細胞瓶中，盲傳第3代的其中一瓶細胞瓶中的細胞出現(xiàn)細胞病變，因此判定為禽流感抗原液滅活不完全。
【主權(quán)項】
1.一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，其特征在于:其包括以下步驟: 1)取至少3瓶細胞瓶培養(yǎng)MDCK細胞24-30h，MDCK細胞生長密度達80%以上時，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞瓶3_4次； 2)向各細胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液，室溫放置15_20min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為25-50yg /ml； 3)將滅活后的禽流感抗原液做10倍稀釋后，各取1-1.5mL分別接種于各個細胞瓶中，將細胞瓶置于35°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30-35min，使滅活后的禽流感抗原液在MDCK細胞上吸附，期間振搖1-2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%; 4)吸附后，在各細胞瓶中分別加入8-10mlDMEM培養(yǎng)液，將細胞瓶繼續(xù)置于上述0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第I代； 5)取至少3瓶已生長24-30h，并且生長密度達80%以上的MDCK細胞，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞瓶3_4次； 6)向各細胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液，室溫放置15_20min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為25-50yg /ml； 7)取上述步驟4)凍融后的細胞培養(yǎng)液1-1.5mL，接種于各細胞瓶中，將細胞瓶置于350C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30-35min，期間振搖1_2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%; 8)在各細胞瓶中分別加入8-10mlDMEM培養(yǎng)液，將細胞瓶繼續(xù)置于上述CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第2代； 9)重復(fù)上述步驟5)-步驟8)，此為盲傳第3代； 10)滅活檢驗方法: 結(jié)果判定:上述步驟中盲傳3代的各瓶細胞均無細胞病變出現(xiàn)，則判定為禽流感抗原液滅活完全;各代細胞瓶任何I瓶出現(xiàn)細胞病變，則判定為禽流感抗原液滅活不完全。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，其特征在于:所述細胞瓶為T25細胞瓶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，其特征在于:所述胰酶在各細胞瓶培養(yǎng)液中的終濃度為2.5-5.0yg /ml。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，其特征在于:所述DMEM培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基用超純水配制而成，并調(diào)節(jié)pH至7.4。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，包括以下步驟：將滅活后的禽流感液在MDCK細胞上吸附30-35min；吸附后，在細胞瓶中加入DMEM培養(yǎng)液，將細胞瓶置于35℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天后，收獲細胞培養(yǎng)液，并凍融3次；然后連續(xù)盲傳3代，盲傳3代的各瓶細胞均無細胞病變出現(xiàn)，則判定為禽流感抗原液滅活完全；各代細胞瓶任何1瓶出現(xiàn)細胞病變，則判定為禽流感抗原液滅活不完全。本發(fā)明采用MDCK傳代細胞系進行禽流感滅活抗原的滅活檢驗，因傳代細胞的穩(wěn)定和均一，并且因采用無外源微生物污染的MDCK細胞，從而保證了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【IPC分類】C12Q1/02, C12Q1/70
【公開號】CN105603126
【申請?zhí)枴緾N201610155427
【發(fā)明人】王玉玲, 黃金妹
【申請人】福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年3月18日