快速測(cè)定中藥知母口服給藥后活性成分藥代動(dòng)力學(xué)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)，具體涉及一種采用微透析取樣技術(shù)結(jié)合超高效液相-三重 四級(jí)桿檢測(cè)器測(cè)定知母活性成分藥代動(dòng)力學(xué)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge ·的干燥根莖?？?、甘、 寒。歸肺、胃、腎經(jīng)。清熱瀉火，滋陰潤(rùn)燥。用于外感熱病，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內(nèi) 熱消渴，腸燥便秘。皂苷及黃酮類是知母主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血糖及改善老 年癡呆等作用。鑒于知母在臨床具有的良好療效，了解該藥的藥代動(dòng)力學(xué)特征，繪制出具有 吸收相、峰濃度、分布相和消除相的完整血藥濃度曲線，并對(duì)該曲線進(jìn)行非房室模型處理， 經(jīng)處理提取的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)用于解釋藥物的體內(nèi)過程、指導(dǎo)新藥開發(fā)以及指導(dǎo)臨床合理用藥 十分必要。
[0003] 微透析技術(shù)是研究生物動(dòng)態(tài)變化的一種新型在體取樣技術(shù)，其主要原理為在非平 衡條件（即流出的透析液中待測(cè)化合物的濃度低于它在探針膜周圍樣品基質(zhì)中濃度)將一 種具有透析作用且充滿液體的微細(xì)探針置于生物體內(nèi)，與探針周圍組織進(jìn)行物質(zhì)交換后達(dá) 到取樣的目的。微透析技術(shù)具有"活體、實(shí)時(shí)、微創(chuàng)、微量、準(zhǔn)確、高效"等特點(diǎn)，在藥物研究中 具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種大鼠口服知母提取物后3個(gè)活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè) 定方法。
[0005] 本發(fā)明是大鼠口服知母提取物后3個(gè)活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法，該方法是 采用微透析取樣，與超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)大鼠口服知母提取物后血液中 新芒果苷、芒果苷、知母皂苷ΒΠ 的藥物濃度，其特征在于采用微透析技術(shù)取樣，實(shí)現(xiàn)了微創(chuàng) 手術(shù)后大鼠活體連續(xù)取樣，所得樣品可避免蛋白質(zhì)及酶等生物大分子物質(zhì)干擾，直接采用 精密儀器進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)采用反透析法，選擇枸櫞酸葡萄糖溶液(ACD溶液)為灌流液，空白 灌流液以1. 〇μ1 · mirT1的流速灌流探針，收集樣品，每份30μ1，流動(dòng)相由乙腈和0.1 %甲酸水 按一定比例梯度洗脫。
[0006] 微透析取樣時(shí)，待測(cè)物擴(kuò)散在探針膜兩側(cè)，某一灌流速度下，探針內(nèi)的待測(cè)物和組 織液間的待測(cè)物在連續(xù)流動(dòng)的灌流液影響下不一致，即微透析樣品的濃度(C dlalysate)不等 于組織臟器的真實(shí)濃度(Ctlssue)，因此微透析樣品需要校正回收率。（張英豐，吳陽(yáng)，汪小根， 等關(guān)于微透析法與血藥濃度法的異同及其藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)特殊處理的探索與思考[J].中國(guó)實(shí) 驗(yàn)方劑學(xué)雜志，201 1,17( 12):276-278. ;VIEIRA M LT, SINGH R P，DEREND0RF H.Simultanexus HPLC analysis ol triamoinolone acetonide and budesonidein microdialysate and rat plasma：Application to a pharmacokinetic；study[J] ? Journal of Chromatography B，2010,878(29) :2967-2973.)理論上體內(nèi)校正時(shí)無(wú)法得知 相對(duì)回收率(relative recovery，RR)，如果相對(duì)損失率(relative loss，RL)近似等于RR， 則能夠采用反透析法測(cè)定藥物經(jīng)過半透膜時(shí)的流失量來(lái)間接校正探針的回收率。實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè) 得的回收率米用增量法(反映相對(duì)回收率RR)和減量法(反映相對(duì)損失率RL)兩種方法進(jìn)行 比較。
[0007] 增量法：用空白厶0)灌流液在5種不同的流速下（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.(^1· mirT1)灌流浸于含藥ACD灌流液中的血液微透析探針。每種流速在平衡1小時(shí)，收集樣品，測(cè) 定透析液中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII的含量，采用公式RR = Cdiaiysis/CperfUsate X 100 % (Cdialysis :透析液中待測(cè)物濃度;CpCTf usate :含藥灌流液濃度），計(jì)算相對(duì)回收率。減量法:用含 藥灌流液在5種不同的流速下(0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4. ΟμL · mirT1)灌流浸于不含藥的空 白灌流液中的血液微透析探針。每種流速在平衡1小時(shí)，收集樣品，測(cè)定透析液中新芒果苷、 芒果苷、知母皂苷BII的含量，采用公式RL= (Cperfusate-Cdiaiysis) /Cperfusate X 100 %，計(jì)算相對(duì) 損失率。最終選擇反透析法作為微透析實(shí)驗(yàn)的矯正方法，灌流液流速選擇1 .ΟμL · mirT1進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)。
[0008] 微透析采用的灌流液有林格氏液(濃度分別為147mm〇l/L、4mm〇l/L、1.3mmol/L的 氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣的混合溶液)及ACD液(濃度為3.5mmol/L檸檬酸、7.5mmol/L檸檬酸 鈉、13.6mmol/L葡萄糖的混合溶液）。將探針分別置于林格氏及ACD含藥灌流液中，用不含藥 的空白灌流液以1. ΟμL · mirT1的速度灌流探針，每種濃度平衡1小時(shí)，收集樣品，每份30μ1， 收集6份。測(cè)定透析液中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷ΒΙΙ的濃度，計(jì)算探針的回收率。結(jié)果新 芒果苷、芒果苷、知母皂苷ΒΙΙ在ACD溶液中的回收率要高于林格氏溶液，加之ACD溶液具有 一定的抗凝作用，因此實(shí)驗(yàn)中采用ACD溶液作為灌流液。
[0009] 液相條件中流動(dòng)相由乙腈和0.1 %甲酸水按一定比例梯度洗脫，加入甲酸可以促 進(jìn)被分析物的離子化，提高檢測(cè)的靈敏度。采用短柱進(jìn)行分析可縮短樣品分析時(shí)間，提高了 分析速度，有利于大批量樣品的快速檢測(cè)。
[0010] 由此，本發(fā)明提供一種快速測(cè)定中藥知母口服給藥后活性成分藥代動(dòng)力學(xué)的方 法，其采用微透析取樣技術(shù)聯(lián)合超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜，具體包含如下步驟:模型動(dòng) 物口服知母提取物，并在0~12h內(nèi)采用微透析分別取樣收集不同時(shí)間點(diǎn)透析液;將上述透 析液分別進(jìn)行超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜分析;繪制動(dòng)物模型口服知母提取物后活性成 分的血藥濃度-時(shí)間曲線圖。
[0011] 本發(fā)明中的模型動(dòng)物包含大鼠、小鼠、兔子。
[0012] 動(dòng)物模型口服知母提取物后活性成分包含新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII (結(jié)構(gòu) 式見圖1)。
[0013] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):上述微透析過程采用反透析法，選擇枸櫞酸葡萄糖溶 液為灌流液。
[0014]作為本發(fā)明的更進(jìn)一步改進(jìn):所述微透析過程中的灌流液以1 .ΟμL · mirT1的流速 灌流探針，收集透析液樣品，每份30μ1;超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)中流動(dòng)相由乙腈 和0.1 %甲酸水按進(jìn)行梯度洗脫。
[0015] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步細(xì)化，快速測(cè)定中藥知母口服給藥后活性成分藥代動(dòng)力學(xué)的 方法具體包括以下步驟：
[0016] Α.含藥林格氏灌流液的配制：配成新芒果苷、芒果苷、知母皂苷ΒΙΙ濃度分別為 400ng/mL、554.6ng/mL、900ng/mL的含藥枸橡酸葡萄糖灌流液；
[0017] B.探針回收率的測(cè)定：用步驟A中制備所得的芒果苷、新芒果苷、知母皂苷ΒΠ 含藥 灌流液以Ι.ΟμΙ · mirT1的速度灌流探針，平衡2小時(shí)后每隔30分鐘收集一次透析液，連續(xù)收 集5份樣品，測(cè)定透析液中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII的濃度，計(jì)算探針的體內(nèi)回收率；
[0018] C.模型動(dòng)物體內(nèi)植入探針并取樣，采用微量收集器于4°C每30分鐘自動(dòng)收集一份 透析液樣品，持續(xù)收集10小時(shí)；
[0019] D.混合標(biāo)準(zhǔn)品的配制:精密稱取新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII對(duì)照品，加70%乙 腈定容，配成濃度分別為1.0mg/mL、0.92mg/mL、l .52mg/mL的新芒果苷、芒果苷、知母阜苷 BII對(duì)照品儲(chǔ)備液;分別精密吸取新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII對(duì)照品儲(chǔ)備液并用枸櫞酸 葡萄糖灌流液定容至50ml，得含藥枸櫞酸葡萄糖灌流液，其中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷 BII 的終濃度分別為 1000ng/mL、831 ng/mL、2160ng/mL;
[0020] E.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：步驟D中所述新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII對(duì)照品儲(chǔ)備液分別 以空白透析液稀釋，配成一系列濃度的混標(biāo)工作液，新芒果苷的濃度分別為12.4、62.0、 124、186、248、6201^/11^，芒果苷濃度分別為10.8、54.0、108.0、162.0、216.0、540.01^/11^， 知母皂苷BII濃度分別為37.5、188、375、563、750、1880ng/mL。；超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì) 譜測(cè)定，并以峰面積為縱坐標(biāo)，成分濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程；
[0021] F.樣品檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理:將步驟C收集所得的微透析樣品置于色譜進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)襯管 中，直接進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算透析液樣品中各目標(biāo)物的含量；
[0022] G.繪制動(dòng)物模型口服知母提取物后中藥有效成分的血藥濃度-時(shí)間曲線圖。
[0023]超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜分析的色譜、質(zhì)譜條件如下：色譜條件：Merck Purospher STAR色譜柱2.1 X 50mm，2. Ομπι;流動(dòng)相0.1 %甲酸水溶液A-乙腈