兩頭尖提取物的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種兩頭尖提取物的制備方法，以及該得到的兩頭尖提取物在制備抗肺癌藥物或抗肺癌保健品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]兩頭尖又名竹節(jié)香附，為毛莨科銀蓮花屬多被銀蓮花(AnemoneraddeanaRegel)的干燥根莖。主要分布于東北三省及山東、河北、山西等地，以吉林省產(chǎn)量最多。藥材多夏季采挖，除去殘莖及須根，曬干。此藥首載于明朝劉文泰所著《本草品匯精要》。具有“祛風(fēng)除濕，消癰腫”之功效。早在清代，王旭高的“定癌散”曾以兩頭尖治療乳癌?，F(xiàn)在臨床用于風(fēng)寒濕痹，手足拘攣，骨節(jié)疼痛，癰疽腫痛。多與其它藥物配伍，不單方入藥，是著名中成藥“活絡(luò)丹”和“再造丸”的主要原料。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，兩頭尖中含有大量的皂苷類成分，還含有內(nèi)酯類、揮發(fā)油類、油脂類、生物堿、氨基酸、微量元素及糖類等成分。研究表明兩頭尖還具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗驚厥作用。
[0003]授權(quán)公告號為CN1210289C的發(fā)明專利公開了一種兩頭尖提取物的制備工藝，該工藝主要采用乙醇提取+硅膠干柱層析的方法進(jìn)行分離，得到無色粉末狀結(jié)晶兩頭尖皂甙Do授權(quán)公告號為CN1312170C的發(fā)明專利公開了一種兩頭尖提取物的制備工藝，它主要是通過采用堿提取+乙醇提取的方法來提高目的提取物中銀蓮花素A的收率和純度。授權(quán)公告號為CN102584927B的發(fā)明專利公開了一種從兩頭尖中分離提取一類三萜類化合物的方法，該方法先乙醇提取，接著依次用石油醚萃取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取，再經(jīng)柱層析，高效液相制備，得到目的產(chǎn)物。該提取方法步驟繁瑣，耗時(shí)，重復(fù)性差，穩(wěn)定性差，不適用工業(yè)化大生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種兩頭尖提取物的制備方法，該方法對樣品初步處理后，主要采用高效液相色譜進(jìn)行分離純化，分離方法穩(wěn)定，重復(fù)性高，制備量大，操作簡單省時(shí)，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
[0006]—種兩頭尖提取物的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0007](I)以兩頭尖為原料，室溫陰干處理后，在40?60°C溫度下烘干脫水，然后進(jìn)行超微粉碎處理，獲得超微粉；
[0008](2)將步驟⑴所得的超微粉按Ig: (4?12)mL的料液比加入乙酸乙酯，提取I?6h，每0.5?Ih攪拌一次，室溫靜止I?5h后取上清液過濾除去雜質(zhì)，收集濾渣重復(fù)I?3次；將被乙酸乙酯提取過的濾渣置陰涼處晾干，稱重后，換成乙醇繼續(xù)按上述方法提??；合并乙醇提取的上清液，減壓濃縮至膏狀，獲得兩頭尖小分子提取物；
[0009](3)按質(zhì)量體積比(g/mL)加入5?10倍的甲醇-水溶液，進(jìn)行超聲溶解，溶解后過有機(jī)濾膜，得到兩頭尖小分子提取物的樣品溶液；
[0010](4)將步驟(3)獲得的樣品溶液在填料為C18的反相分離色譜柱上進(jìn)行分離純化，采用A為超純水、B為甲醇的二元流動(dòng)相體系，分離純化的條件為:0?5min 95% A-5%B(即按體積百分比95% A、5% B配比而成，下同理)等度洗脫，5?15min 87% A-13%B等度洗脫，15?25min 40 % A-60 % B等度洗脫，25?35min 30 % A-70 % B等度洗脫；35?45min 25% A-75% B等度洗脫，45?55min 100% B等度洗脫，根據(jù)紫外吸收光譜收集47-48min洗脫液(LTJ-ET-17峰)，減壓濃縮并烘干，得到本發(fā)明目的組分兩頭尖提取物。
[0011]作為優(yōu)選，所述步驟(I)中超微粉碎在-20?4°C溫度下進(jìn)行，時(shí)間為5?20min。
[0012]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中乙酸乙酯的提取溫度為30?70°C溫度，乙醇的提取溫度為40?70°C溫度，進(jìn)一步優(yōu)選為65°C。
[0013]作為優(yōu)選，所述步驟(3)中甲醇-水溶液的甲醇與水的體積比為4: I。
[0014]作為優(yōu)選，所述步驟(3)中有機(jī)濾膜的孔徑為0.22?0.45 μ m
[0015]作為優(yōu)選，所述步驟(4)中反相分離色譜柱的直徑為50_、柱長為250_，C18的粒徑為8?10 μ m。
[0016]作為優(yōu)選，所述步驟(4)中分離純化時(shí)的檢測波長為210nm，進(jìn)樣量為lg，流速為80mL/mino
[0017]作為優(yōu)選，所述步驟(2)、(4)中減壓濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行，工藝條件為溫度70°C、真空度 0.08Mpa。
[0018]本發(fā)明進(jìn)一步提供上述提取得到的兩頭尖提取物在制備抗肺癌藥物或抗肺癌保健食品中的應(yīng)用。該兩頭尖提取物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊、注射劑等。
[0019]按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的理解，兩頭尖提取物的給藥劑量應(yīng)根據(jù)治療對象的年齡、體重、疾病嚴(yán)重程度等因素而定，一般可以是15-50mg/天。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和顯著效果:
[0021]1、先采用乙酸乙酯對兩頭尖超微粉進(jìn)行提取，將其中的小極性物質(zhì)提取出，達(dá)到一次初步分離，再用乙醇提取，有利于目的組分的提取，并且乙酸乙酯和乙醇均可回收再利用，既節(jié)約了提取成本，又低毒無污染。
[0022]2、采用制備色譜對含有活性組分的小分子提取物進(jìn)行分離純化，相對于傳統(tǒng)的溶劑萃取法，該制備方法穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，制備量大，試劑消耗量小，得到的物質(zhì)組分批次之間一致性高，分離純化過程的時(shí)間周期短。
[0023]3、本方法經(jīng)過超微粉碎、溶劑提取、過濾雜質(zhì)、制備色譜分離純化等一系列步驟后，從兩頭尖乙酸乙酯提取物中分離得到了五環(huán)三萜類物質(zhì)組分，工藝簡單，易于實(shí)施，具有制備量大、穩(wěn)定可控、適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，所得活性組分可用于研發(fā)制備抗肺癌藥物或抗肺癌保健食品。
[0024]4、本發(fā)明拓展了抗肺癌藥物或抗肺癌保健食品的原料來源，擴(kuò)大了兩頭尖的應(yīng)用范圍，使兩頭尖成為抗肺癌藥物或抗肺癌保健食品的有效組分原料，顯著提高了兩頭尖的附加值。
【附圖說明】
[0025]圖1所示的是本發(fā)明各實(shí)施例兩頭尖提取物的制備方法中的色譜分離圖；
[0026]圖2所示的是本發(fā)明實(shí)施例1得到的兩頭尖提取物各組分抗肺癌活性的實(shí)時(shí)監(jiān)測圖，其中(a)為 LTJ-ET-1 ?LTJ-ET-8 組分，(b)為 LTJ-ET-9 ?LTJ-ET-15 組分，(c)為LTJ-ET-16 ?LTJ-ET-19 組分。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0028]1、原料、材料:
[0029]兩頭尖采摘自吉林省長春市并經(jīng)過鑒定；A549細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院提供。
[0030]2、試劑:
[0031]超純水由密立博純水儀生產(chǎn)；分析級乙醇購自天津市康科德科技有限公司；色譜級甲醇、乙酸乙酯購自Honeywell公司；DMS0購自北京索萊寶科技有限公司；F_12K培養(yǎng)基購自Gibco公司ο
[0032]3、儀器設(shè)備:
[0033]超微粉碎機(jī)購自山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司；臺式冷凍離心機(jī)購自Thermo公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞容生化儀器廠；C18反相分離色譜柱購自天津博納艾杰爾科技有限公司；制備型高效液相色譜儀購自江蘇漢邦科技有限公司；細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測儀購自ACEAB1sciences Inc (艾森生物科學(xué)公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自英國RS B1tech公司。
[0034]實(shí)施例1:
[0035]本實(shí)施例兩頭尖提取物的制備方法，包括以下步驟:
[0036](I)兩頭尖室溫陰干處理后，在60°C下烘干脫水，然后在-20°C超微粉碎5min，即得兩頭尖超微粉。
[0037](2)取上述兩頭尖超微粉lKg，加入12L分析乙酸乙酯在60°C提取6h，每0.5h攪拌一次。室溫靜止5h后取上清液過濾除去雜質(zhì)，收集濾過液，重復(fù)3次。將被乙酸乙酯提取過的粉末置陰涼處晾干，稱重后，比例換成IKg:10L，繼續(xù)按上述方法提取。所得濾過液減壓濃縮至膏狀并于烘箱65°C干燥處理，即獲得兩頭尖小分子提取物。
[0038](3)加入10倍體積的超純水、色譜級甲醇混合溶液，超純水與甲醇的比例為1:4，將步驟(2)所得的小分子提取物進(jìn)行超聲溶解，溶解后過0.22 μ m有機(jī)濾膜，即得到兩頭尖小分子提取物的樣品溶液。
[0039](4)將獲得的兩頭尖小分子提取物的樣品溶液在以填料為反向分離材料C18(粒徑8?10 μ m)的制備色譜上進(jìn)行分離純化，采用的分離色譜柱直徑為50mm、柱長為250mm，采用A為超純水、B為甲醇二元流動(dòng)相體系進(jìn)行分離純化；分離純化的條件為:0?5min，95% A, 5% B ;5 ?15min，87% A, 13% B ；15 ?25min，40% A,60% B, 25 ?35min，30% A,70% B ；35 ?45min，25% A, 75% B ；45 ?55min，0% A，100% B，按照梯度對樣品進(jìn)行洗脫；檢測波長:210nm;進(jìn)樣量:lg;流速:80mL/min。按照色譜峰進(jìn)行收集，色譜峰如圖1 (a)所示，收集47-48min洗脫液(LTJ-ET-17峰)，減壓濃縮并烘干，得到本發(fā)明目的組分兩頭尖提取物。
[0040]將以上得到的兩頭尖提取物組分LTJ-ET-17經(jīng)過制備液相色譜進(jìn)一步分離純化及NMR碳?xì)渥V分析，判定主要是含有單糖或者雙糖的五環(huán)三萜類物質(zhì)。
[0041]實(shí)施例2:
[0042]本實(shí)施例兩頭尖提取物的制備方法，包括以下步驟:
[0043](I)兩頭尖室溫陰干處理后，在40°C烘干脫水，然后在-10°C超微粉碎5min，即得兩頭尖超微粉。
[0044](2)取上述兩頭尖超微粉lKg，加入8.0L分析乙醇在50°C提取4h，每Ih攪拌一次，室溫靜止3h后取上清液過濾除去雜質(zhì)，收集濾過液，重復(fù)3次。將被乙酸乙酯提取過的粉末置陰涼處晾干，稱重后，換成乙醇繼續(xù)按上述方法提取。所得濾過液減壓濃縮至膏狀并于烘箱65°C干燥處理，即獲得兩頭尖乙醇提取物。
[0045](3)加入8倍體積的超純水、色譜級甲醇將步驟⑵所得