一種通過花藥培養(yǎng)獲得制干辣椒單倍體植株的方法及培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過花藥培養(yǎng)獲得制干辣椒單倍體植株的方法及培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是辣椒種植大國，辣椒資源相當(dāng)豐富，總產(chǎn)量已居世界之首，其中制干辣椒種植面積近600萬畝，年產(chǎn)干辣椒60多萬噸，產(chǎn)值近60億元，已成為農(nóng)民致富的重要經(jīng)濟作物之一。新疆具有獨特的種植制干辣椒的氣候條件，是世界適宜種植辣椒的少數(shù)地區(qū)之一，常年種植面積和產(chǎn)量均占全國的65%以上，加工辣椒產(chǎn)業(yè)已成為新疆“紅色產(chǎn)業(yè)”的重要組成部分。但適合新疆種植的加工辣椒品種不多，迫切需要通過生物技術(shù)手段促進(jìn)品種選育。
[0003]花藥培養(yǎng)技術(shù)是迄今為止創(chuàng)造純合基因型的最有效手段，在育種工作中，利用這項技術(shù)除了可以縮短材料的純化時間，對雜交Fl、F2的花藥培養(yǎng)可選擇出特異的性狀外，還可以通過花藥培養(yǎng)方法建立DH群體，直接獲得純化的品系，進(jìn)而作為育種中間材料或親本育成新品種。
[0004]生物技術(shù)和常規(guī)育種相結(jié)合，已成為當(dāng)代作物育種的一大特點。應(yīng)用單倍體培養(yǎng)所得的雙單倍體植株，無論是在作物的育種，還是在遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀的QTL定位及基因的克隆篩選等分子生物學(xué)研究都有著重要的應(yīng)用價值。目前辣椒花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng)仍然存在著基因型限制、培養(yǎng)過程繁瑣、成胚率低、畸形苗率高等需要克服的問題，限制了單倍體育種技術(shù)在育種實踐中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種通過花藥培養(yǎng)獲得制干辣椒單倍體植株的方法及培養(yǎng)基配方。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下實施方案獲得:首先供試?yán)苯酚诖杭?4月)植于大田中，待現(xiàn)蕾后，選取無病蟲害植株的花蕾。取材時間一般在晴天、無(少)露水時進(jìn)行，在溫度較低、日照較弱的8:00~10:00進(jìn)行，選擇花瓣與花萼近等長或根據(jù)花藥顏色以1/3為紫色的花蕾，將取好的花蕾立即放于冰盒中，回實驗室后放置4°C冰箱預(yù)處理1~7天。
[0007]預(yù)處理后的花蕾放在0.1%升汞溶液中表面消毒lOmin，無菌水沖洗3-4次，倒在無菌濾紙上，用兩把尖頭小鑷子一把夾住花蕾底部一把鑷子將花瓣部分拔出，然后將花瓣剝離開取出花藥接種在已滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿放30個左右的花藥，然后用Paraf i Im 膜封口。
[0008]誘導(dǎo)培養(yǎng)基以改良的MSB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置兩種激素組合處理(0.1 mg/L 2, 4-D+0.1 mg/L KT和0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L KT)。米用高壓蒸汽滅菌，滅菌時間為15-20 min0
[0009]28 °C恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后繼代于分化培養(yǎng)基上(生長素減半的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)，繼續(xù)黑暗培養(yǎng)可見明顯子葉的成熟胚狀體和胚性愈傷組織(圖1-3)。剝離成熟胚狀體，28 °C光照條件(20001UX)下進(jìn)行生根培養(yǎng)(圖4)，長出發(fā)達(dá)根系后進(jìn)行水培煉苗(圖5)，馴化后移栽至營養(yǎng)土和蛭石(3:1)混拌的土缽中(圖6);植株長勢穩(wěn)健后用脫脂棉蘸取0.25%秋水仙素進(jìn)行加倍處理48小時(圖7)。
[0010]本發(fā)明所提供的進(jìn)行辣椒花藥培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為改良的MSB培養(yǎng)基，由MS的無機鹽成分和85培養(yǎng)基的有機成分組成，誘導(dǎo)培養(yǎng)基具體組成如下:硝酸鉀1.9 g/L、硫酸銨1.65 g/L、磷酸二氫鉀0.17 g/L、七水硫酸鎂0.37 g/L、二水氯化鈣0.44 g/L、四水硫酸錳22.3 mg/L、硼酸6.2 mg/L、七水硫酸鋅8.6 mg/L、碘化鉀0.83 mg/L、二水鉬酸鈉0.25mg/L、五水硫酸銅0.025 mg/L、六水氯化鈷0.025 mg/L、乙二胺四乙酸鈉37.3 mg/L、七水硫酸亞鐵27.8 mg/L、甘氨酸2mg/L、煙酸I mg/L、鹽酸硫胺素10 mg/L、鹽酸卩比卩多醇I mg/L、肌醇 100 mg/L，鹿糖 30 g/L、瓊脂 9 g/L, pH 為 5.8-6.0。
[0011 ] 所述辣椒為雜交Fl的二倍體辣椒，包括牛角椒、羊角椒、線椒等制干辣椒品種。
[0012]本發(fā)明具有以下有益效果:1、從一批來自全國適應(yīng)新疆種植，生物學(xué)形狀優(yōu)秀的辣椒雜交Fl代或雜交組合進(jìn)行花藥培養(yǎng)實驗，建立起一套簡便高效的再生體系，達(dá)到愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)20%以上，出胚率達(dá)到5%以上，正常苗率60%以上，10周內(nèi)獲得完整再生植株。2、本發(fā)明的培養(yǎng)方法簡便，僅需要在固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次后就可以獲得再生植株。3、本發(fā)明的培養(yǎng)基是改良的MSB培養(yǎng)基，通過改善了有機物成分促進(jìn)再生植株根的發(fā)育，有利于獲得更多的正常再生植株。
【附圖說明】
[0013]
圖1繼代一次后的胚狀體發(fā)生圖2單個花藥分化的成簇胚狀體圖3花藥分化的胚性愈傷組織圖4正常的再生植株圖5水培煉苗圖6再生苗的移栽圖7染色體加倍
【具體實施方式】
[0014]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0015]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0016]無機鹽購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和北京化學(xué)試劑公司；2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、激動素(KT)和維生素購自SIGMA公司；肌醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蔗糖購自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，瓊脂粉購自北京振泰科技創(chuàng)新發(fā)展中心。
[0017]實驗步驟如下:選擇花瓣與花萼近等長或根據(jù)花藥顏色以1/3為紫色的花蕾，放置4°C冰箱預(yù)處理I一7天不等。將處理好的材料在超凈工作臺無菌條件下，把花蕾放在
0.1%升汞溶液中表面消毒lOmin，用無菌水沖洗3次。消毒后倒在無菌濾紙上，用兩把尖頭鑷子，一把槍形鑷子夾住花蕾底部一把眼科鑷子將花瓣部分拔出，然后將花瓣剝離開取出花藥接種，每皿放30個左右的花藥，Parafilm膜封口。
[0018]誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良的MSB培養(yǎng)基附加植物激素組成，MSB基本培養(yǎng)基組成為:硝酸鉀1.9 8/1、硫酸銨1.65 g/L、磷酸二氫鉀0.17 g/L、七水硫酸鎂0.37 g/L、二