巨尾桉廣林29莖尖脫毒及快速增殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及桉樹的莖尖脫毒及快速增殖方法，尤其涉及巨尾桉廣林29莖尖脫毒及 快速增殖方法，屬于巨尾桉廣林29的組培快繁領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 桉樹(Eucalyptus)又名尤加利樹，是桃金娘科、桉屬植物的總稱，原產(chǎn)于澳大利 亞，是澳大利亞木本植物中最具代表性的樹種。桉樹是世界著名的三大速生樹種之一，具有 適應(yīng)性強(qiáng)、速生豐產(chǎn)、周期短等特點(diǎn)。桉樹木材抗腐耐磨，林油兼?zhèn)?，廣泛應(yīng)用于建筑、造紙、 精油、能源等行業(yè)，即可培育用材林、經(jīng)濟(jì)林等，也是荒山綠化及沿海防護(hù)林的優(yōu)良樹種。
[0003] 中國很早就引進(jìn)了桉樹樹種，已經(jīng)成為桉樹種植的第二大國。巨尾桉廣林29更以 適應(yīng)能力強(qiáng)，抗逆性強(qiáng)，速生質(zhì)優(yōu)豐產(chǎn)，出漿率高，干粗，通直等優(yōu)點(diǎn)在中國南部地區(qū)廣泛種 植。廣林29是以澳大利亞種源東門巨桉優(yōu)樹(Eucalyptus grandis)作為母本、以印度尼西 亞種源東門尾葉桉優(yōu)樹(Eucalyptus urophylIa)為父本雜交而成的雜交種，具有父本母本 的優(yōu)良特性，一年生樹可高達(dá)6m以上，單位面積生長量可達(dá)45m 3/年*hm2，抗風(fēng)性好，伐粧萌 芽力強(qiáng)，一般一年即可郁閉成林;耐貧瘠，營養(yǎng)吸收能力強(qiáng)，具有較快經(jīng)濟(jì)和社會效益，是深 受廣西林農(nóng)歡迎的桉樹品種之一。
[0004]桉樹遺傳性高度雜合，許多性狀受多基因控制，傳統(tǒng)的育種方法周期長，選育工作 量繁重，采用扦插或壓條等常規(guī)繁殖方法育苗成活率低，很難提供大量苗木，限制大面積推 廣造林。利用基因工程方法既可解決常規(guī)育種的不足，也可滿足定向培育桉樹新品種的要 求。組培快繁是在保持品種特性的基礎(chǔ)上，進(jìn)行種苗的無性快速繁殖，是優(yōu)良品種資源高效 利用，桉樹種植產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化的重要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵技術(shù)。從20世紀(jì)60年代就已經(jīng)開始對桉樹 進(jìn)行組培技術(shù)研究，并獲得了多個桉樹品種的再生植株。在桉樹組培脫毒離體快繁體系中， 繁殖系數(shù)的大小，生長速率的快慢，快速增殖是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，繼代增殖就成為了樹種快速繁 殖方法能否成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
[0005] 目前，桉樹組培快繁的再生率低，多數(shù)情況下所用的植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度和種 類隨著桉樹品種的不同而不同。因此建立高效穩(wěn)定的巨尾桉廣林29離體快繁無菌苗體系和 植株轉(zhuǎn)化再生體系，對加速商品化大規(guī)模育苗造林，更好的利用基因工程手段選育出優(yōu)質(zhì) 桉樹新品種，提高其產(chǎn)量和質(zhì)量以及對建立轉(zhuǎn)基因再生系統(tǒng)等均具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是建立一種巨尾桉廣林29莖尖脫毒及快速增殖方法， 該方法通過改良增殖培養(yǎng)階段的激素組合，大大提高了芽苗的增殖效率，增殖時間短，且芽 苗生長健壯，為巨尾桉廣林29的大規(guī)模工廠化育苗及遺傳轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)的建立奠定基礎(chǔ)。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明首先公開了一種巨尾桉廣林29莖尖脫毒及快速增殖方法，包括以下步驟， (1)將巨尾桉廣林29的外植體消毒，接種到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)；（2)將萌發(fā)的腋 芽接種到增殖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)叢生芽；（3)將叢生芽中的單個芽接種到生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根， 獲得完整再生植株;其中，所述增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0-2.0mg/L+NAA 0-0.15mg/L+KT O-0 · 15mg/L+Vc 100mg/L+鹿糖30g/L+Phytagel 3g/L;優(yōu)選的，所述增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0 · 5-2 · Omg/L+NAA 0 · 02-0 · 15mg/L+KT0 · 02-0 · 15mg/L+V。100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L;最優(yōu)選的，所述增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.02mg/L+KT 0.05mg/L+Vc 100mg/L+鹿糖30g/L+Phytagel 3g/L。誘導(dǎo)叢生芽的條件為：光照16小時/天，光強(qiáng)2500-4000Ix，溫度為25-28°C，每20-30天繼代一次。一般經(jīng)過兩次繼代培養(yǎng)即可獲得大量桉樹無 菌苗。
[0009]目前關(guān)于桉樹組培快繁的研究主要集中在赤桉、尾葉桉和鄧恩桉，而對巨尾桉廣 林29的研究相對較少。本發(fā)明以中國廣西廣泛栽培的廣林29桉樹品種為受體材料，對增殖 培養(yǎng)階段增殖培養(yǎng)基的激素組合進(jìn)行改良，篩選適宜的激素濃度配比。
[0010]本發(fā)明首先考察了 κτ(激動素)對芽苗增殖的影響，結(jié)果表明在其他條件相同的培 養(yǎng)條件下，在繼代增殖培養(yǎng)基中添加適量KT對芽苗生長和增殖的綜合效果較好，有效芽苗 數(shù)多，比未添加 KT的增殖培養(yǎng)基的苗數(shù)提高66.7%，增殖系數(shù)可達(dá)4.0以上，且芽苗健壯、整 齊度高，生根率達(dá)95%;而未添加 KT的增殖培養(yǎng)基上的芽苗則長勢瘦弱，葉片發(fā)黃，有效芽 苗數(shù)少，生根率低。
[0011] 為更好的確定增殖培養(yǎng)基中有效激素濃度，本發(fā)明進(jìn)一步在基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ) 上添加不同濃度梯度的6-BA、NAA和KT三種激素，觀察叢生芽誘導(dǎo)情況。結(jié)果表明，KT激素用 量在0.05~0.1mg/L范圍內(nèi)，隨著KT激素使用量的增加，對增殖效率有較理想的促進(jìn)作用。 其中，MS+KT0.05mg/L+6-BA I .Omg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖30g/L組合的增殖系數(shù)最高，達(dá)到 5.03,比其他激素組合培養(yǎng)基的增殖系數(shù)高19.2個百分點(diǎn)以上;增殖效率快，達(dá)到最高增殖 系數(shù)的平均時間僅28天，增殖時間比其他激素組合培養(yǎng)基縮短10天以上;而且芽苗生長狀 態(tài)良好，有效芽苗數(shù)多，芽苗莖節(jié)長，平均芽長比其他處理長38%以上。因此，本發(fā)明確定培 養(yǎng)基MS+KT 0.05mg/L+6_BA 1.0mg/L+NAA 0.02mg/L+鹿糖30g/L+V。100mg/L+Phytagel 3g/L，pH 5.8-6.0為廣29桉樹最佳的芽增殖培養(yǎng)基。
[0012] 另外，在繼代增殖培養(yǎng)過程中不可過早切取萌生芽，不利于芽增殖叢生分化;若待 芽開始有些半木質(zhì)化，過晚轉(zhuǎn)移繼代萌生芽，芽增殖效率明顯降低，也不利于叢生芽分化。
[0013] 本發(fā)明所述巨尾桉廣林29莖尖脫毒及快速增殖方法中，所述腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS +6-BA 0_2.0mg/L+NAA 0_0.5mg/L+Vc 100mg/L+鹿糖30g/L+Phytagel 3g/L;優(yōu)選的，所述 胺芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+V(； 100mg/L+鹿糖30g/L+Phytagel 3g/ L。培養(yǎng)基中添加適量的Vc可有效的遏制培養(yǎng)材料褐化及死亡。本發(fā)明所述生根培養(yǎng)基為I/ 2MS+NAA 0-0 .lmg/L+IBA 0.2-0.5mg/L，還含有蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L。
[0014] 本發(fā)明所述的巨尾桉廣林29莖尖脫毒及快速增殖方法中，所述增殖培養(yǎng)基、腋芽 誘導(dǎo)培養(yǎng)基或生根培養(yǎng)基的PH均為5.8-6.0。本發(fā)明所述外植體為巨尾桉廣林29當(dāng)年扦插 枝條的中上部半木質(zhì)化的莖段;優(yōu)選為，巨尾桉廣林29當(dāng)年扦插枝條的中上部4-7節(jié)莖段或 包括頂芽以下4-6位腋芽并半木質(zhì)化的莖段。所述消毒是用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒1分鐘， 無菌水漂洗3-5次;再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %氯化汞消毒5-10分鐘，無菌水漂洗5-6次。
[0015] 本發(fā)明巨尾桉廣林29莖尖脫毒及快速增殖方法的操作簡便，增殖效率高，時間短， 省時省工，對促進(jìn)桉樹大規(guī)模工廠化育苗及桉樹轉(zhuǎn)化再生體系的建立具有重要的理論及實(shí) 踐意義。
[0016] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0017] 本發(fā)明以巨尾桉廣林29桉樹品種為受體材料，通過采用適宜的外植體，改良增殖 培養(yǎng)階段的激素組合，加入適量KT，并篩選最佳增殖培養(yǎng)基，獲得芽繁芽再生途徑，建立了 桉樹莖尖脫毒快速擴(kuò)繁體系，大大促進(jìn)了不定芽的增殖和生長，不僅增殖效率高，增殖時間 短，而且芽苗生長健壯、整齊度高，為廣29桉樹的大規(guī)模工廠化育苗造林及遺傳轉(zhuǎn)化再生系 統(tǒng)的建立奠定基礎(chǔ)。
[0018] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義
[0019] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0020] "增殖系數(shù)"是單個外植體再生形成的有效芽的平均數(shù)。
[0021] MS，指MS培養(yǎng)基，參見文獻(xiàn)Murashige T&Skoog F(1962)A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissues cultures.Physiol.Planta.15: 473-479 ;1/2MS是指其大量元素為MS培養(yǎng)基的50 %。
[0022] 6-BA，為6-芐氨基嘌呤，又稱6-芐基腺嘌呤。
[0023] NAA，為萘乙酸。
[0024] Vc，為維生素 C，又稱抗壞血酸。
[0025] KT，kinetin，為激動素。
[0026] IBA，為吲哚丁酸。
[0027] "Phytagel"，植物凝膠，是從假單胞菌分泌而來的一種瓊脂的替代物，是葡萄糖醛 酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物，具有無色、透亮和高韌性的特點(diǎn)，是配制植物組織培養(yǎng)基和 微生物培養(yǎng)基的主要成分。<