NA。采用通用引 物（27f: 5，-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3，；1492r: 5，-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）進(jìn)行 16S rDNA的PCR擴增，擴增體系（50ul):lXTaq PCR Master Mix 25yL，DNA 模板 lyL(O.l-lOng)，引物（10ymol/L)各 2 yL，ddH20 20μΙ^ΡΟ?反應(yīng)條件為：94°C 預(yù)變性 4min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2 min，30個循環(huán)；72°C延伸 10 min，4°C終止反 應(yīng)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于_20°C冰箱保存，送至生工生物工程(上海)有限 公司進(jìn)行純化，雙向測序并拼接輸出全序列。
[0020] 將獲得的DNA序列（見Seql)，通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast檢測并下載已測序列的相 似序列和參考序列。運用軟件Clu StalX(Versi〇n 1.83)對多序列進(jìn)行比對。選取其中6個典 型菌株的16SrDNA序列，以小單抱菌屬種類Micromonospora viridifaciens為外群，運用 分析軟件M e g a 6.0 6中的鄰位相連法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果表明，菌株D T J - 2 4與 Streptomyces lavenduIae聚類在一個分支上（圖2)。因此，結(jié)合形態(tài)、生理生化特征及 16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株DTJ-24鑒定為淡紫灰鏈霉菌(S. Iavendulae)。
[0021] 實施例3拮抗菌無菌發(fā)酵濾液的制備 將菌株DTJ-24接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝量70%，發(fā)酵罐體積30L，在攪拌速度150-200rpm/min、通氣量15-20%、溫度25-30°C、pH值6.5~7.5條件下，進(jìn)行恒溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵5 天后，發(fā)酵液5000r/min離心處理，制備上清液，上清液采用無菌濾膜過濾，制備無菌發(fā)酵濾 液。
[0022]液體培養(yǎng)基配方如下：酵母浸粉4.0g/L，麥芽浸粉10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，水 1000ml，pH值7.5。
[0023] 實施例4盆栽試驗 為了檢驗菌株DTJ-24無菌發(fā)酵濾液對軟棗獼猴桃干腐病的生防效果，進(jìn)行了本試驗。 試驗于2015年4-6月進(jìn)行，試驗用軟棗獼猴桃苗1年生，生長勢均一，栽培基質(zhì)為軟棗獼猴桃 栽培基地土壤，栽培裝置為營養(yǎng)缽(規(guī)格30cm X 30cm) 〇
[0024] I、軟棗獼猴桃移植 自遼寧丹東軟棗獼猴桃種植基地挖土備用。稱取適量土，混入2 %有機肥，每個營養(yǎng)缽 中裝入3.5公斤混土。在營養(yǎng)缽中裝滿基質(zhì)后略壓緊，然后移入1株軟棗獼猴桃苗，根據(jù)需要 補充水分，15d后待軟棗獼猴桃生長穩(wěn)定進(jìn)行后續(xù)試驗。
[0025] 2、病原菌孢子懸液制備 將軟棗獼猴桃干腐病病原菌接種于PDA試管斜面中27°C培養(yǎng)7d。取已培養(yǎng)好的病原菌 斜面菌種一支，加入5ml無菌水，輕輕將瓊脂表面的孢子刮下，該孢子懸浮液置于已滅菌 50ml三角瓶內(nèi)，瓶中預(yù)先放置數(shù)粒無菌玻璃球，充分振搖后用滅菌的脫脂棉進(jìn)行過濾，并用 無菌水沖洗濾渣2~3次，最終使濾液體積達(dá)到10.0 ml，得孢子懸浮液。用血球計數(shù)板測孢子 懸液濃度，最終制備5.0 X IO5個/ml的病原菌孢子懸液。
[0026] 3、拮抗菌無菌發(fā)酵濾液的制備:方法見實施例2。
[0027] 4、病原菌感染軟棗獼猴桃 用無菌刀片在健康的試驗軟棗獼猴桃樹干部位劃出0.5cm長十字傷口，用移液器在軟 棗獼猴桃樹干劃傷部位接種5ul步驟2中制備的病原菌孢子液，培養(yǎng)48h。
[0028] 5、莖部噴施防效 用步驟3制備的無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液進(jìn)行莖部噴施，將藥液均勻的噴灑在莖部， 以滴水為度;無菌水噴施作為陰性對照;咪鮮胺1000倍稀釋液噴施作為陽性對照。每個處理 組20株，3次重復(fù)。每隔15天噴藥1次，連續(xù)噴施3次，于45d后統(tǒng)計病情指數(shù)，計算防治效果， 結(jié)果見表1。
[0029] 6、灌根處理防效:用步驟3制備的無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液100mL進(jìn)行灌根處理； 無菌水處理作為陰性對照；咪鮮胺1000倍稀釋液處理作為陽性對照。每個處理組20株，3次 重復(fù)。每隔15天用藥1次，連續(xù)處理3次，于45d后統(tǒng)計病情指數(shù)，計算防治效果，結(jié)果見表2。
[0030] 軟棗獼猴桃干腐病樹干的病情分級標(biāo)準(zhǔn)0級:無?。?級：發(fā)病部出現(xiàn)淺褐色斑點， 病斑平均長度<1.0 cm;3級:病斑沿樹干方向向兩側(cè)擴大，病斑平均長度在1.1~5.0 cm;5 級：出現(xiàn)典型的病斑，病斑平均長度在5.1~9.0 cm:7級:病斑擴大，平均長度為9.1~15.0 cm;9級:發(fā)病樹干的葉片出現(xiàn)萎蔫，病斑平均長度>15 · 0 cm〇
[0031] 病情指數(shù)=[Σ (各級病株數(shù)X對應(yīng)各級值)/(調(diào)查總株數(shù)X發(fā)病最高級值）]X 100。相對防效(％)=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]X 100。
[0032]表1莖部噴施防治效果
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)后相同字母表示經(jīng)鄧肯新復(fù)極差法檢驗差異不 顯著（Ρ>0·05) 表2灌根處理防治效果_
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)后相同字母表示經(jīng)鄧肯新復(fù)極差法檢驗差異不 顯著（Ρ>0·05) 由表1、2可見，菌株DTJ-24無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液與化學(xué)農(nóng)藥咪鮮胺1000倍稀釋液 處理相比無明顯防效差異，且防治效果良好。兩種不同的施用方式:莖部噴施和灌根處理均 能達(dá)到較好的防治效果。因此與施用化學(xué)農(nóng)藥相比，本發(fā)明工藝簡單，成本低，使用方便，可 以降低軟棗獼猴桃栽培過程中化學(xué)農(nóng)藥的使用，具有安全環(huán)保的優(yōu)點及良好的應(yīng)用和開發(fā) 前景。
【主權(quán)項】
1. 一株淡紫灰鏈霉菌在防治軟棗獼猴桃干腐病中的應(yīng)用。2. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，一株淡紫灰鏈霉菌的無菌發(fā)酵濾液用于防治軟 棗獼猴桃干腐病。3. 權(quán)利要求2所述的無菌發(fā)酵濾液用于防治軟棗獼猴桃干腐病，其特征在于，施用時， 將無菌發(fā)酵濾液按比例1:100與水沖兌后，直接噴施于軟棗獼猴桃莖部或灌于軟棗獼猴桃 根部。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株淡紫灰鏈霉菌在防治軟棗獼猴桃干腐病中的應(yīng)用，涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的一株淡紫灰鏈霉菌保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC？No.9972。本發(fā)明使用一株淡紫灰鏈霉菌的無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液直接噴施于軟棗獼猴桃莖部或灌于軟棗獼猴桃根部，對軟棗獼猴桃干腐病防效可達(dá)88.6%。本發(fā)明工藝簡單，成本低，使用方便，可以降低軟棗獼猴桃栽培過程中化學(xué)農(nóng)藥的使用，具有安全環(huán)保的優(yōu)點，及良好的應(yīng)用和開發(fā)前景。CGMCC No.997220141114
【IPC分類】A01P3/00, A01N63/02
【公開號】CN105638746
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李娟 , 王旭, 王東來
【申請人】遼東學(xué)院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月26日