帶正電荷具有肝靶向作用的新型三氧化二砷制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種帶正電荷具有肝靶向作用的新型三氧化二砷制劑的制備技術(shù)。
[0002]【背景技術(shù)】:
三氧化二砷(As2O3)是中藥砒霜的主要有效成分，其注射液最早用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病。研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷不僅對(duì)急性早幼粒白血病療效顯著，對(duì)實(shí)體瘤也有著較好的抑制作用。然而As2O3在體內(nèi)半衰期較短，給藥后會(huì)被快速清除;此外高劑量的As2O3會(huì)帶來(lái)神經(jīng)麻痹、肝功能衰竭等毒副作用，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服抗癌藥物As2O3在使用過(guò)程中無(wú)靶向功能，而且體內(nèi)半衰期較短的缺陷，從而制備出一種帶正電荷具有肝靶向功能的新型三氧化二砷制劑。
[0004]本發(fā)明的步驟如下:
1)將As2O3溶于氫氧化鈉水溶液中，制成As2O3的氫氧化鈉溶液；
2)將乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶于三氯甲烷中，制成乳酸-羥基乙酸的氯仿溶液；
3)在磁力攪拌下，將As2O3的氫氧化鈉溶液加入到乳酸-羥基乙酸的氯仿溶液中，然后冰浴超聲乳化，形成W/0初乳；
4)將聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖(PLC)溶解于乳化劑水溶液中，制成含聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖的乳化劑水溶液；
5)將W/0初乳與含聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖的乳化劑水溶液混合，冰浴超聲乳化形成W/0/W復(fù)乳；
6)將W/0/W復(fù)乳與低濃度的乳化劑水溶液均勻混合后，蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，離心收集沉淀、去離子水洗滌，冷凍干燥得載As2O3納米粒(As203-PLGA/PLC NPs)。
[0005]本發(fā)明以As2O3的氫氧化鈉溶液為內(nèi)水相，以乳酸-羥基乙酸的氯仿溶液為油相，先以油相包封內(nèi)水相，形成W/0初乳。再以含聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖的乳化劑水溶液為外水相。采用可生物降解、生物相容性良好的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為包封材料，采用雙乳化-溶劑揮發(fā)法制得As203-PLGA/PLC NPs。
[0006]本發(fā)明方法制備方法簡(jiǎn)單，制備得到的納米粒尺寸均一，形貌可控，分散性好，包封率、載藥量高，在體外可穩(wěn)定釋放，在體內(nèi)體外都表現(xiàn)出良好的抗腫瘤性能，體現(xiàn)了一定的肝靶向功能，使As2O3能夠直接靶向肝癌腫瘤部位并在腫瘤部位實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放，提尚治療效果。
[0007]進(jìn)一步地，本發(fā)明步驟I)中，所述As2O3的氫氧化鈉溶液中As2O3含量為60 mg/mL。
[0008]為了提高載藥納米粒的包封率及載藥量，步驟2)中，所述乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)含量為3O mg/mL ο
[0009]為了提高載藥納米粒的包封率及載藥量，步驟3)中，所述As2O3的氫氧化鈉溶液和乳酸-羥基乙酸的氯仿溶液的混合體積比為1:20。
[0010]步驟3)中，所述超聲乳化時(shí)，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為90 S，以促進(jìn)形成均勻的W/0初乳液。
[0011]為了使聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖成功包覆在納米粒的表面，制備帶有正電荷的載藥納米粒，步驟4)中，所用乳化劑為泊洛沙姆;所述乳化劑水溶液中聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖的濃度為I mg/mL。
[0012]步驟5)中，超聲乳化時(shí)，超聲功率為500W，超聲時(shí)間為180S，以形成分散均勻的W/0/W復(fù)乳液。
[0013]為了進(jìn)一步分散穩(wěn)定W/0/W復(fù)乳，步驟6)中，所述低濃度的乳化劑水溶液為濃度為0.9% (w/v)的泊洛沙姆水溶液。
[0014]另外，步驟4)中，所述聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖是按以下方法合成的:將Ig殼聚糖溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的6 mL醋酸中，再加入pH為4.7的20 mL TEMED.HCL緩沖溶液，然后分別加入3.83mg EDC和2.30mg NHS，30min后加入0.16mg聚乙二醇和1.43mg乳糖酸，在反應(yīng)體系的pH值為4-6的條件下，于35°C條件下攪拌反應(yīng)，取得粗產(chǎn)物，將粗產(chǎn)物置于透析袋中透析后，經(jīng)冷凍干燥，得聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖。該合成方法可一步法將聚乙二醇和乳糖酸修飾到殼聚糖上，獲得雙功能殼聚糖衍生物。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為PLC的合成示意圖。
[0016]圖2為雙乳化-溶劑揮發(fā)法合成As203-PLGA/PLCNPs的示意圖。
[0017]圖3為PLGA、PLC、As203-PLGA/PLCNPs的紅外光譜圖。
[0018]圖4為As203_PLGA/PLC NPs的TEM圖。
[0019]圖5為圖4的放大圖。
[0020]圖6為AFS測(cè)得的As2O3的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021]圖7為藥物As2O3從As203-PLGA/PLC NPs中的體外緩釋曲線。
[0022]圖8為As2O3對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞的抑制作用效果圖。
[0023]圖9為As203-PLGA/PLC NPs對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞的抑制作用效果圖。
[0024]圖10為As203-PLGA/PLC NPs空球?qū)MMC-7721肝癌細(xì)胞的抑制作用效果圖。
[0025]圖11為接受不同藥物治療后小鼠腫瘤體積變化曲線(X±SD，n=5)圖。
[0026]圖12為靜脈注射生理鹽水后腫瘤病理學(xué)檢測(cè)(HE染色)照片。
[0027]圖13為靜脈注射As2O3后腫瘤病理學(xué)檢測(cè)(HE染色)照片。
[0028]圖14為靜脈注射六8203-?11^/?^: NPs后腫瘤病理學(xué)檢測(cè)(HE染色)照片。
[0029]圖15為靜脈注射生理鹽水后腎臟器官病理學(xué)檢測(cè)(HE染色)照片。
[0030]圖16為靜脈注射As2O3后腎臟器官病理學(xué)檢測(cè)(HE染色)照片。
[0031]圖17為靜脈注射As203-PLGA/PLCNPs后腎臟器官病理學(xué)檢測(cè)(HE染色)照片。
【具體實(shí)施方式】
[0032]一、制備 As203-PLGA/PLCNPs:
1、合成聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖PEG/LA-CS (簡(jiǎn)稱:PLC): 稱取Ig殼聚糖(CS)溶解于6 mL醋酸(2%)中，加入20 mL TEMED.HCL緩沖溶液(ρΗ=4.7)稀釋，攪拌20min，然后分別加入3.83mgEDC和2.30mg NHS，30min后加入0.16mg聚乙二醇(mPEG)和1.43mg乳糖酸(LA)，35°C下攪拌反應(yīng)36h，反應(yīng)過(guò)程中嚴(yán)格控制pH4-6，反應(yīng)過(guò)程如圖1所示。粗產(chǎn)物置于透析袋中透析4天，冷凍干燥即可得到聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖(PLC)。
[0033]2、制備As203_PLGA/PLC NPs:
如圖2所示:
(I)將As2O3溶于氫氧化鈉質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉水溶液中，配成As2O3含量為60mg/mL的As2O3的氫氧化鈉溶液，作為內(nèi)水相。
[0034](2)將乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶于三氯甲烷中，制成PLGA濃度為30mg/mL的PLGA氯仿溶液，作為油相。
[0035](3)在磁力攪拌下，將內(nèi)水相加入到PLGA氯仿溶液中，然后冰浴超聲乳化(超聲條件:300 W，90 S)，形成W/0初乳。
[0036](4)將聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖(PLC)溶解于9%的泊洛沙姆水溶液中(外水相)，制得溶液中PLC濃度為I mg/mL的PLC乳化劑水溶液。
[0037](5)將W/0初乳與PLC乳化劑水溶液混合，冰浴超聲乳化(超聲條件:500 W，180s)，形成W/0/W復(fù)乳。
[0038](6)將胃/0/胃復(fù)乳與0.9% (w/v)泊洛沙姆水溶液均勻混合后，蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，離心收集沉淀、去離子水洗滌，冷凍干燥得As203-PLGA/PLC NPs。
[0039]二、As203-PLGA/PLCNPs 的表征及性質(zhì):
1、紅外表征
圖3為PLGA、PLC、As203-PLGA/PLC NPs的紅外光譜圖，在AS2O3-PLGA/PLC NPs譜圖中，1760cm—1處出現(xiàn)了PLGA中C=0(羧基)的特征吸收峰，2997 cm—1處為甲基中C-H的伸縮振動(dòng)峰，2947 cm—1處為亞甲基中C-H的伸縮振動(dòng)峰，且1180 cm—1處出現(xiàn)C-O的伸縮振動(dòng)，表明了納米粒中-C00-的存在;此外，3544cm— 1處出現(xiàn)的寬峰為PLC中O-H的伸縮振動(dòng)與N-H伸縮振動(dòng)吸收峰的重疊峰，由此可以說(shuō)明As203-PLGA/PLC NPs成功制備。
[0040]2、納米粒形貌及電位
圖4為As203-PLGA/PLC NPs的TEM，可以看出制備出的納米粒呈