一種治療前列腺癌的car-t細(xì)胞制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療前列腺癌的CAR-T細(xì)胞制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]嵌合抗原受體是模擬T細(xì)胞受體功能的人工受體，由抗原識別結(jié)構(gòu)域(配體或單鏈抗體)和T細(xì)胞的一系列信號結(jié)構(gòu)域依次連接而成。利用嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞能夠?qū)⑴潴w或抗體的特異識別作用與T細(xì)胞的效應(yīng)功能聯(lián)合起來，進(jìn)行腫瘤靶向免疫治療。此療法是對人體自身T細(xì)胞加以改造后用于治療，相對于放和化療，其毒副作用較弱。由于嵌合抗原受體修的T細(xì)胞通過其抗原識別結(jié)構(gòu)域識別腫瘤細(xì)胞表面抗原，然后啟動殺傷作用，因此其治療具有靶向性。由于該種T細(xì)胞通過其嵌合抗原受體直接識別腫瘤細(xì)胞表面抗原，然后通過其信號結(jié)構(gòu)域直接將識別信號傳速至胞內(nèi)，激活T細(xì)胞的殺傷活性，因此可以繞開常規(guī)細(xì)胞免疫的主要組織相容復(fù)合體(MHC)限制性，從而有效克服腫瘤細(xì)胞MHC表達(dá)量低造成的免疫逃逸，并可以靶向非蛋白質(zhì)腫瘤抗原。
[0003]前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是常見男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率已超過肺癌，成為嚴(yán)重威脅男性健康第二大惡性腫瘤。雖然早期PCa易治療，生產(chǎn)率高，但是三期、四期PCa死亡率高，且易出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移。PCa目前的治療方式主要有手術(shù)，放療和化療。PCa切除術(shù)手術(shù)創(chuàng)傷大、術(shù)后尿失禁和勃起功能障礙的發(fā)生率極高，且手術(shù)死亡率亦高;而放療和化療帶來的副作用大，會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。
[0004]PSA是一種含有237個(gè)氨基酸的單鏈多肽，具有組織特異性，只存在于人前列腺腺泡及導(dǎo)管上皮細(xì)胞胞漿中，不表達(dá)于其它細(xì)胞，血清PSA是前列腺癌的特異性標(biāo)志物，而在正常細(xì)胞不表達(dá)。因此，PSA是前列腺癌靶向治療的潛在位點(diǎn)。國外已有報(bào)道抗CD19-CAR-T細(xì)胞在B細(xì)胞腫瘤中的應(yīng)用取得了良好的治療效果，因此利用抗PSA-CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的嵌合抗原受體hPSAscFV-CD8-CD28-CD3G表達(dá)于T細(xì)胞表面，使T細(xì)胞特異性殺傷PSA陽性的腫癌細(xì)胞，提高前列腺癌的治療效果和晚期前列腺癌癥患者的生存率，為前列腺癌患者的臨床治療提供一種新的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種新的有效的前列腺癌治療方法，利用抗PSAscFv構(gòu)建出的抗PSA嵌合抗原受體(hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G)，表達(dá)該嵌合抗原受體的CAR-T細(xì)胞也具有其獨(dú)特性，初步研究其腫瘤特異性殺傷功能，以進(jìn)一步探討其在臨床治療中的應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種治療前列腺癌的CAR-T細(xì)胞制劑，由嵌合了靶細(xì)胞抗原受體hPSAscFV-CD8-CD28-
⑶3ζ的CAR-T細(xì)胞、人血白蛋白、生理鹽水按一定比例配制而成。制劑的優(yōu)選配比為:CAR-T細(xì)胞的濃度為(4?6) X 107個(gè)/ml，質(zhì)量體積比為2%的人血白蛋白，余量為生理鹽水。
[0007]進(jìn)一步的，所述CAR-T細(xì)胞中CAR為hPSAscFv-CD8 -CD28_CD3G，具體組成為:由抗人PSA單克隆抗體ant1-PSA輕鏈和重鏈可變區(qū)hPSAscFv、CD8鉸鏈區(qū)、CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、以及CD3G胞內(nèi)信號區(qū)串聯(lián)構(gòu)成；
進(jìn)一步的，所述CAR-T細(xì)胞的靶細(xì)胞抗原為PSA。
[0008]進(jìn)一步的，所述CAR-T細(xì)胞由一種表達(dá)載體所表達(dá)，其中，表達(dá)載體為慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒的一種，優(yōu)選慢病毒。
[0009]—種治療前列腺癌的CAR-T細(xì)胞制劑的制備方法，主要包括以下步驟:
(1)載體構(gòu)建:構(gòu)建能夠表達(dá)hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G的載體；
(2)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的病毒的包裝:采用步驟(I)中構(gòu)建的載體包裝慢病毒，獲得經(jīng)過包裝的慢病毒；
(3)T細(xì)胞分離與擴(kuò)增培養(yǎng):抽取患者自身血液，從中分離出T細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；
(4 )Τ細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與制備:采用步驟(2 )中經(jīng)過包裝的慢病毒對步驟(3 )中培養(yǎng)所得T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得CAR-T細(xì)胞；
(5)將步驟(4)制備的CAR-T細(xì)胞與人血白蛋白按比例混勻，余量用生理鹽水補(bǔ)足，制備成CAR-T細(xì)胞制劑。
[0010]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
(1)本發(fā)明首次將嵌合了前列腺癌細(xì)胞抗原受體的CAR-T細(xì)胞，用來治療前列腺癌，治療效果顯著，從根本上提供了一種治療前列腺癌的方法；
(2)本發(fā)明首次將嵌合了前列腺癌細(xì)胞抗原受體的CAR-T細(xì)胞與人血白蛋白聯(lián)合制作成一種靶向治療前列腺癌的免疫細(xì)胞制劑，人血白蛋白可以維持CAR-T細(xì)胞的活性。本制劑成分明確，制作簡便，為CAR-T細(xì)胞的臨床推廣應(yīng)用提供了更便捷的方法；
(3 )本發(fā)明所選用的靶細(xì)胞抗原為PSA: PSA是前列腺癌的最重要的特異性標(biāo)志物。70-80%的前列腺癌病人在發(fā)病期間都有PSA基因高表達(dá)的特征，PSA幾乎表達(dá)于所有的前列腺癌細(xì)胞表面，而在其他細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)，在臨床上被認(rèn)為是前列腺癌的經(jīng)典腫瘤標(biāo)記物。因此采用PSA作為靶細(xì)胞抗原可以大大提高使CAR-T細(xì)胞特異性識別和殺傷前列腺癌細(xì)胞的能力，降低前列腺癌患者的復(fù)發(fā)和提高治療效果；
(4)本發(fā)明采用的是第三代CAR，第三代CAR的重組T細(xì)胞能夠增加γ-干擾素和抗細(xì)胞凋亡蛋白的分泌，在抗腫瘤活性、存活周期及細(xì)胞因子釋放方面均顯著提高。
[0011]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施案例并配合附圖詳細(xì)說明如后。本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】由以下實(shí)施例及其附圖詳細(xì)給出。
【附圖說明】
[0012]圖1表示從患者外周血分離得到的T細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增曲線。
[0013]圖2體外培養(yǎng)擴(kuò)增所得T細(xì)胞的活力測定。
[0014]圖3顯示用不同MOI值的慢病毒感染T細(xì)胞的感染效率(用FITC-標(biāo)記的蛋白檢測s cFv在T細(xì)胞上的表達(dá)率)。
[0015]圖4顯示CAR-T細(xì)胞對PSA表達(dá)陽性的前列腺癌細(xì)胞PC3的特異性殺傷率。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1 CAR-T細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建:
(1)PCR擴(kuò)增目的片段抗PSA抗體以pCDNA3-scBW431/26-hFc質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物，在其5 ’、3 ’端分別加上Nhe1、Sal I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，CEA Up NheI上游引物5 ’ -AGG CTAGCATGGGATAGGAG CTG TATCAT-3 ' , PSA-HER2 Dn SalI 下游引物 5'-AGGTCGACGGTATCGAATAAGCTTTG-3 ’，反應(yīng)條件95 °C 預(yù)變性5min ,95 °C 變性 I Os，68 °C 退火 15s，72°C延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增完成后取出2yL樣品進(jìn)行鑒定；
(2)雙酶切LV-EFla-Luciferase-PGK-FP635-WPRE載體、目的片段PSA--CD3-2A-GFP載體酶切體系為50yL: 10 XGreen buffer 5yL，載體3yL，NheI酶lyL，SalI酶lyL，H20 40yL；目的片段酶切體系為50yL: 10 XGreen buffer 5yL，目的片段回收產(chǎn)物2.5y