化或再生水平。（E)示出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用于 獲得椎間盤的盤高度指數(shù)。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射線放射圖片，其用于獲得椎間 盤的盤高度指數(shù)。未轉(zhuǎn)導的軟骨細胞治療具有椎間抗退化作用。
[0016]圖9-A~圖9-D示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。（A)示出手術(shù)前兔脊柱的MRI 放射圖片；（B)示出手術(shù)后八(8)周兔脊柱的MRI放射圖片，其中（i)使L2/3盤損傷并注射細 胞培養(yǎng)基DMEM，（ i i)脊柱部位L3/4處無穿刺和無治療，為對照組，和（ii i)使L4/5盤損傷并 注射預(yù)處理的軟骨細胞;箭頭指向L2/3和L4/5盤區(qū)。（C)示出上面(A)中描述的兔的X射線放 射圖片，其用于獲得椎間盤的盤高度指數(shù)從而測量它的形態(tài)、它的退化或再生水平。（D)示 出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用于獲得椎間盤的盤高度指數(shù)。預(yù)處理的軟骨 細胞治療具有椎間抗退化作用。
【具體實施方式】
[0017] 如本文使用的關(guān)于核酸、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或其衍生物的術(shù)語"生物活性"，定義 為該核酸或氨基酸序列模擬野生型核酸或蛋白質(zhì)所誘導的已知生物功能的能力。
[0018] 如本文使用的術(shù)語"結(jié)締組織"是連接和支撐其它組織或器官的任何組織，包括但 不限于哺乳動物宿主的韌帶、軟骨、腱、骨和滑膜。
[0019] 如本文使用的術(shù)語"結(jié)締組織細胞"或"結(jié)締組織的細胞"包括在結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn) 的細胞，例如分泌膠原細胞外基質(zhì)的成纖維細胞、軟骨的細胞(軟骨細胞)和骨的細胞(成骨 細胞/骨細胞），以及脂肪的細胞(脂肪細胞)和平滑肌細胞。優(yōu)選地，該結(jié)締組織細胞是成纖 維細胞、軟骨細胞或骨細胞。更優(yōu)選地，該結(jié)締組織細胞是軟骨細胞。應(yīng)當認識到本發(fā)明可 用結(jié)締組織細胞的混合培養(yǎng)物實施，也可以用單一類型的細胞。還應(yīng)當認識到組織細胞可 用例如化學物或放射治療，以便該細胞穩(wěn)定表達感興趣的基因，優(yōu)選TGF-m。優(yōu)選地，該結(jié) 締組織細胞在注入到宿主有機體中時不會引起不良免疫反應(yīng)。應(yīng)當理解同種異體細胞可應(yīng) 用于此，以及自體細胞可應(yīng)用于細胞介導的基因治療或體細胞治療。
[0020] 如本文使用的"結(jié)締組織細胞系"包括起源于共同親本細胞的多種結(jié)締組織細胞。
[0021] 如本文使用的"透明軟骨"是指覆蓋關(guān)節(jié)表面的結(jié)締組織。僅為舉例，透明軟骨包 括但不限于關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨和鼻軟骨。
[0022]特別地，已知透明軟骨能自我更新，對變化起反應(yīng)并提供較少摩擦的穩(wěn)定運動。發(fā) 現(xiàn)甚至在同一關(guān)節(jié)內(nèi)或在厚度、細胞密度、基質(zhì)組成和機械特性不同的關(guān)節(jié)中透明軟骨仍 保持相同的總體結(jié)構(gòu)和功能。透明軟骨的一些功能包括對壓力有驚人的剛性、回彈性和分 散重量負荷的特殊能力、將軟骨下骨上的峰壓力減至最小的能力，和很好的耐久性。
[0023] 大體上和組織學上，透明軟骨表現(xiàn)為抵抗變形的光滑、堅固的表面。軟骨的細胞外 基質(zhì)包含軟骨細胞，但缺少血管、淋巴管或神經(jīng)。維持軟骨細胞和基質(zhì)之間相互作用的精 巧、高度有序的結(jié)構(gòu)起保持透明軟骨結(jié)構(gòu)和功能的作用，同時保持低水平的代謝活動。參考 文獻O'Driscoll, J.Bone Joint Surg.，80A: 1795-1812,1998詳細描述了透明軟骨的結(jié)構(gòu) 和功能，該文獻通過引用整體地合并在此。
[0024] 如本文使用的"可注射的"組合物是指不包括這種結(jié)構(gòu)的組合物，這種結(jié)構(gòu)為用允 許細胞附在其上并允許細胞生長成一層以上的任何材料或形狀制成的，一般是植入而非注 射的各種三維支架、框架、篩網(wǎng)或氈結(jié)構(gòu)。在一個實施例中，本發(fā)明注射方法典型地通過注 射器進行。但可采用任何方式注射感興趣的組合物。例如，也可采用導管、噴霧器，或溫度依 賴性聚合凝膠。
[0025] 如本文使用的"幼年軟骨細胞"是指從小于兩歲的人中獲取的軟骨細胞。典型地， 該軟骨細胞優(yōu)選從肢體的透明軟骨區(qū)中獲得，例如手指、鼻子、耳垂等。幼年軟骨細胞可用 作治療缺損或損傷的椎間盤的同種異體的供體軟骨細胞。
[0026] 如本文使用的術(shù)語"哺乳動物宿主"包括動物王國的成員，包括但不限于人類。
[0027] 如本文使用的"混合細胞"或"細胞的混合物"或"細胞混合物"是指多種細胞的組 合，該細胞包括用感興趣的基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導的第一細胞群和未轉(zhuǎn)導的第二細胞群。
[0028] 在本發(fā)明的一個實施例中，混合細胞可以指多種結(jié)締組織細胞的組合，該結(jié)締組 織細胞包括已用編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員的基因或DNA轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導的細胞和未用編 碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員的基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導的細胞。典型地，未用編碼轉(zhuǎn)化生長因子β 超家族成員的基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導的細胞與已用TGF超家族基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導的細胞的比例為3-20:1。該范圍可包括約3-10:1。特別地，就細胞數(shù)而言，該范圍可以為約10:1。但應(yīng)當理解， 這些細胞的比例無需固定到任何特定范圍，只要這些細胞的組合可通過減慢或延緩缺損椎 間盤的退化而有效治療損傷的椎間盤即可。
[0029] 如本文使用的"非盤軟骨細胞"是指從除椎間盤軟骨組織以外的身體任何部分分 離出的軟骨細胞。本發(fā)明的非盤軟骨細胞可用于同種異體移植或注射到患者中從而治療缺 損或損傷的椎間盤。
[0030] 如本文使用的術(shù)語"患者"包括動物王國的成員，包括但不限于人類。
[0031] 如本文使用的術(shù)語"預(yù)處理的"細胞是指已被活化或改變從而表達某些基因的細 胞。
[0032] 如本文使用的椎間盤退化的"減慢"或"阻止"是指與給定時間內(nèi)在導致正常退化 的損傷部位正常發(fā)現(xiàn)的體積或高度水平相比，椎間盤體積或盤高度隨著時間的不斷保留。 這可表示為與給定時間內(nèi)預(yù)期的正常退化水平相比，體積或高度增大的百分比，例如約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，或90%，或可表示為該部位椎間盤的體積或 高度損傷或消耗的減輕。
[0033]如本文使用的"轉(zhuǎn)化生長因子-iKTGF-β)超家族"包括在胚胎發(fā)育期間影響各式各 樣的分化過程的結(jié)構(gòu)相關(guān)的一組蛋白質(zhì)。該家族包括，正常雄性性發(fā)育所需(Behringer等 人，Nature，345 :167,1990)的穆勒氏抑制物質(zhì)(MIS)、背腹軸形成和成蟲盤形態(tài)發(fā)生所需 (Padgett，等人，Nature，325 :81-84，1987)的黑腹果繩（Drosophila decapentaplegic) (DPP)基因產(chǎn)物、位于卵植物極(Weeks等人，Cell ,51:861-867,1987)的非洲爪蟾Vg-I基因 產(chǎn)物、可誘導非洲爪蟾胚胎的中胚層和前結(jié)構(gòu)形成(Thomsen等人，Cell ,63:485,1990)的活 化素(Mason等人，Biochem,Biophys .Res · Commun ·，135:957-964，1986)，和可誘導新生軟骨 (de novo cartilage)和骨形成（Sampath等人，J.Biol .Chem. ,265:13198,1990)的骨形態(tài) 發(fā)生蛋白（BMP，如81^-2、3、4、5、6和7，成骨素，〇?-1)<^?-0基因產(chǎn)物可影響各種分化過程， 包括脂肪形成、肌形成、軟骨形成、血細胞形成和上皮細胞分化(綜述參見Massague，Cel 1 49:437，1987)，其通過引用完整地合并在此。
[0034]最初合成了作為大前體蛋白的TGF-β家族蛋白質(zhì)，然后在距C-端約110-140個氨基 酸的一簇堿性殘基處進行蛋白水解切割。這些蛋白質(zhì)的C-端區(qū)都是結(jié)構(gòu)相關(guān)的，不同家族 成員可基于其同源性程度分成不同亞組。雖然特定亞組內(nèi)氨基酸序列的同源性為70%~ 90%，但亞組之間的同源性明顯較低，一般為20%~50%。在各種情況下，活性種類似乎是 C-端片段經(jīng)二硫化物連接的二聚體。對于已研究的大部分家族成員，發(fā)現(xiàn)同源二聚體種類 具有生物活性，但對于其它家族成員，如抑制素(Ung等人，Nature ,321:779，1986)和TGF-β (Cheifetz等人，Cell ,48:409,1987)，也檢測到異源二聚體，這些異源二聚體似乎有著不同 于各同源二聚體的生物學性質(zhì)。
[0035] TGF-β基因超家族成員包括TGF-03、TGF-02、TGF-M(雞）、TGF-βΙ、TGF-βδ (非洲爪 蟾）、BMP-2、BMP-4、果蠅 0??、8103-5、8103-6、￥811、0?-1/8103-7、果蠅6(^、60?-1、非洲爪蟾 Vgf、BMP-3、抑制素-M、抑制素-卵、抑制素-α 和 MISc3Massague ,Ann .Rev .Biochem. 67:753-791中討論了這些基因，其通過引用整體地合并在此。
[0036] 優(yōu)選地，TGF-β基因的超家族成員為 TGF-βΙ、TGF-02、TGF-03、BMP-2、BMP-3、BMP-4、 BMP-5、BMP-6、或BMP-7 〇
[0037] 椎間盤
[0038] 椎間盤構(gòu)成脊柱長度的四分之一。寰椎(Cl)與樞椎(C2)和尾骨之間無椎間盤。椎 間盤無血管，因此需要依靠終板來滲透所需營養(yǎng)。終板的軟骨層將盤固定在適當?shù)奈恢谩?br>[0039] 椎間盤是用作脊柱減震系統(tǒng)的纖維軟骨墊，其可以保護椎體、腦和其它結(jié)構(gòu)（即， 神經(jīng)）。該椎間盤可以允許一些椎體活動：伸展和彎曲。單個椎間盤的移動是非常有限的一 但當數(shù)個椎間盤的力結(jié)合時可發(fā)生相當強的運動。
[0040] 椎間盤由纖維環(huán)和髓核組成。纖維環(huán)是堅固的輻射輪胎狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由片層 (lamellae)，連接到椎體終板的膠原纖維同心薄片組成。該薄片以不同角度取向。纖維環(huán)包 圍著髓核。
[0041] 盡管纖維環(huán)和髓核都由水、膠原蛋白，和蛋白聚糖(PG)組成，但髓核中流體(水和 PG)量是最多的。PG分子是很重要的，因為它可吸收并保留水分。髓核含有水合凝膠狀物質(zhì)， 其可以抵抗壓力。髓核中的水分量可因為每天的活動而有所變化。隨著人變老，髓核開始脫 水，這限制了它的減震能力。纖維環(huán)隨著年齡逐漸變得脆弱并開始撕裂。雖然對于一些人這 不會引起疼痛，但對于另一些人或這兩類人都可引起慢性疼痛。
[0042] 由脫水的髓核不能減震引起的疼痛稱為軸性痛或盤間隙痛。這一般是指髓核因退 化性椎間盤疾病逐漸退化。當纖維環(huán)由于損傷或老化過程撕裂時，髓核可開始通過裂隙伸 出（exclude)。這稱為椎間盤突出癥。在整個脊柱中每個椎間盤的后側(cè)附近，主要脊神經(jīng)伸 出到不同的器官、組織、肢體等。非常常見的是，突出椎間盤壓迫這些神經(jīng)(擠壓神經(jīng)），引起 放射痛、麻木、刺痛、活動強度和/或范圍減小。另外，含有炎性蛋白的內(nèi)核凝膠與神經(jīng)的接 觸還可引起明顯疼痛。神經(jīng)相關(guān)的疼痛稱為神經(jīng)根痛。
[0043] 突出椎間盤有許多名稱，對醫(yī)務(wù)人員來說，這些名稱可表示