一種具有細(xì)胞示蹤功能的生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于干細(xì)胞組織工程領(lǐng)域及分子生物學(xué)和分子影像學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種 具有細(xì)胞示蹤功能的生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 青光眼是一組威脅和損害視神經(jīng)及其視覺通路，最終導(dǎo)致視覺功能損害，主要與 病理性眼壓升高有關(guān)的臨床征群或眼病。其視神經(jīng)病變的特征是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC) 的漸進(jìn)性喪失以及其軸突與大腦中樞連接的損害。目前臨床上降低眼內(nèi)壓的主要治療，雖 可以減緩疾病進(jìn)展，但并不能完全阻止病情的進(jìn)一步發(fā)展，尤其是對于晚期青光眼的患者 更是收效甚微。因此，有必要尋找一種新的治療策略，減緩或阻止進(jìn)行性的RGC損害。
[0003] 現(xiàn)已有許多研究通過運(yùn)用干細(xì)胞及組織工程學(xué)技術(shù)，對青光眼神經(jīng)保護(hù)和細(xì)胞替 代兩方面進(jìn)行了積極的嘗試并取得了較大進(jìn)展。但干細(xì)胞移植中存在諸多復(fù)雜和關(guān)鍵的問 題:如細(xì)胞生長部位難以精確控制；移植細(xì)胞不能完全生長分化且難以與宿主細(xì)胞有效整 合，形成功能性突觸鏈接;移植入眼內(nèi)的細(xì)胞存活率較低等等。將干細(xì)胞和組織工程學(xué)有機(jī) 結(jié)合，可增進(jìn)或改善視網(wǎng)膜受損組織修復(fù)的形態(tài)及功能為確保移植體系的質(zhì)量，有必要對 接種于組織支架進(jìn)行體外培養(yǎng)分化的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)及功能的評估和檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明目的是提供一種生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架細(xì)胞示蹤方法，利用該方法可以 直接標(biāo)記追蹤生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架細(xì)胞，從而檢測細(xì)胞在體內(nèi)的迀移、增殖、分化和轉(zhuǎn) 歸情況，可作為生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架細(xì)胞移植評估的一項(xiàng)重要指標(biāo)。
[0005] 本發(fā)明的具有細(xì)胞示蹤功能的生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架是通過以下方法制備的：
[0006] 將GFP基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入hiPSc中，得到攜帶GFP基因的hiPSc，命名為GFP-hiPSc，然后 將GFP-hiPSc誘導(dǎo)形成的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層消化為單細(xì)胞，以該單細(xì)胞作為種子細(xì)胞 經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基重懸后接入包被基質(zhì)膠Matrigel的聚乳酸-羥基乙酸聚合物支架上，于 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化，形成具有細(xì)胞示蹤功能的生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架，所 述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有神經(jīng)營養(yǎng)因子和維持濃度的視網(wǎng)膜分化營養(yǎng)液組成的培養(yǎng)基。
[0007] 優(yōu)選，所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為：每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2 supplement lng、非必須氨基酸lng、肝素2yg，余量為DMEM/F12培養(yǎng)基，所述的DMEM/F12培 養(yǎng)基是由DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基按照體積比1:1混合而成。
[0008] 優(yōu)選，所述的誘導(dǎo)分化是在37°C、5%C02,飽和濕度下進(jìn)行誘導(dǎo)分化。
[0009] 優(yōu)選，所述的將神經(jīng)纖維層消化為單細(xì)胞是將神經(jīng)纖維層放入D-Hanks液中，分離 組織，離棄視網(wǎng)膜組織中色素沉著部分，保留金黃色的組織部分的神經(jīng)纖維層，將分離的神 經(jīng)纖維層組織用PBS沖洗，吸除PBS后用accutase細(xì)胞消化液消化細(xì)胞團(tuán)成單細(xì)胞后加入誘 導(dǎo)分化培養(yǎng)基終止消化，混懸液離心去上清后，得到種子細(xì)胞。
[0010] 優(yōu)選，所述的將GFP基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入hiPSc中是用攜帶GFP基因的逆轉(zhuǎn)率病毒載體轉(zhuǎn) 染hiPSc〇
[0011] 優(yōu)選，所述的用攜帶GFP基因的逆轉(zhuǎn)率病毒載體轉(zhuǎn)染hiPSc是將逆轉(zhuǎn)錄GFP包裝的 PT67細(xì)胞用含有300μg/ml G418的DMEM培養(yǎng)基篩選5天，去除含G418的DMEM培養(yǎng)基，再加 10 %胎牛血清培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)到95-100 %融合后收集上清，將上清聯(lián)合LipofccUimine? 3000 Reagent加入hiPSc中，感染24小時后，獲得GFP-hiPSc。
[0012] 本發(fā)明人團(tuán)隊前期已成功將人源性的iPSc細(xì)胞(hiPSc)誘導(dǎo)分化為人iPSc源性的 3D視網(wǎng)膜（Xiufeng Zhong,et al .Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs,Nat Commun.2014Jun 10；5: 4047)。本發(fā)明將GFP-hiPSc-3D視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的神經(jīng)細(xì)胞接種于PLGA組織膜片，構(gòu)建了 一個具有細(xì)胞示蹤功能的生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架(GFP-iRP)。通過前期實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，選 擇合適的細(xì)胞標(biāo)記方法是成功追蹤種子細(xì)胞移植效果并對其研究的基礎(chǔ)。因此對生物工程 視網(wǎng)膜神經(jīng)支架細(xì)胞進(jìn)行特異性示蹤，根據(jù)其特異性細(xì)胞標(biāo)記追蹤移植細(xì)胞，更加真實(shí)的 反映細(xì)胞的移植狀態(tài)，提供生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架細(xì)胞在體內(nèi)的迀移、增殖、分化和轉(zhuǎn)歸 的有效數(shù)據(jù)。
【附圖說明】：
[0013] 圖1是本發(fā)明對人iPSc(A)細(xì)胞進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)染，細(xì)胞(B)在熒光激發(fā)下呈綠色熒光 (C)，可顯示細(xì)胞的位置及形態(tài)；
[0014] 圖2是本發(fā)明的GFP-hiPSC-3D視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜在熒光激發(fā)下呈綠色熒光，可顯示網(wǎng) 膜的形態(tài)；
[0015] 圖3是本發(fā)明GFP-iRP膜片上的神經(jīng)細(xì)胞在熒光激發(fā)下呈綠色熒光，可顯示細(xì)胞整 體形態(tài)及在支架上的分布情況；
[0016] 圖4是本發(fā)明對移植了GFP-iRP的猴眼進(jìn)行解剖取材(A)，其眼球組織在熒光顯微 鏡下顯示移植的GFP-iRP與視網(wǎng)膜貼附（B)，組織切片顯示GFP-iRP膜片細(xì)胞與視網(wǎng)膜整合 良好。
【具體實(shí)施方式】：
[0017] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0018] 實(shí)施例1:
[0019] -、重組逆轉(zhuǎn)錄GFP病毒制備及轉(zhuǎn)染人iPSc細(xì)胞：
[0020] 將逆轉(zhuǎn)錄GFP(綠色熒光蛋白）包裝的PT67細(xì)胞(ATCC，CRL-12284?)用含300ug/ml G418的DMEM培養(yǎng)基篩選5天，去除含G418的DMEM培養(yǎng)基，再加10 %胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，待 細(xì)胞達(dá)到95-100 %融合后收集上清，將GFP上清聯(lián)合Liporeclamine?. 3000Reagent加入 hiPSc(人源性的iPSc細(xì)胞）中，感染24小時后，獲得GFP-hiPSc(圖1)。
[0021]二、生物工程視網(wǎng)膜神經(jīng)支架（iRP)的制作：
[0022] 1、參照文南犬：Xiufeng Zhong , et al . Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs, Nat Commun.2014Jun 10 ;5:4047中的培養(yǎng)方法，只是將hiPSc換成GFP-hiPSc，其他培養(yǎng)條件相 同，將培養(yǎng)50-60天的GFP-hiPSc-3D視網(wǎng)膜（圖2)的神經(jīng)纖維層放入D-Hanks液中，于50倍正 置顯微鏡下使用0.45mm針頭分離組織，離棄視網(wǎng)膜組織中色素沉著部分(色素層），保留金 黃色的組織部分(神經(jīng)纖維層）；將分離的神經(jīng)纖維層組織使用移液管轉(zhuǎn)移至3.5cm培養(yǎng)皿， 使用PBS沖洗10分鐘；吸除PBS后用accutase細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，置于37 °C培養(yǎng)箱中 30min;過程后期可將細(xì)胞吸入離心管吹打，在10倍正置顯微鏡下見細(xì)胞團(tuán)被消化成單細(xì)胞 后加入2ml誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基終止消化。將混懸液離心（1000轉(zhuǎn)/5min)后吸出上清，得到種子 細(xì)胞(沉淀），將種子細(xì)胞中加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基吹打混勻，將該含有種子細(xì)胞