一種m1型巨噬細胞激活肽與il-2融合蛋白、融合基因、表達載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Ml型巨噬細胞激活肽與IL-2融合蛋 白、融合基因、表達載體及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 動物耐藥菌引起的腹瀉，沙門、大腸桿菌、鏈球菌、藍耳?。≒RRSV)、圓環(huán)病毒 (PCV2)、豬瘟(CSFV)，禽腹瀉、球蟲病等各種細菌、病毒性疾病，以及動物寄生蟲，真菌感染 等長期以來是畜牧、禽蛋養(yǎng)殖中瓶頸限制問題，嚴重阻礙畜牧業(yè)的發(fā)展。目前畜牧養(yǎng)殖中， 主要以抗生素添加解決臨床問題，隨著藥物的濫用，嚴重破壞了動物消化道的微生態(tài)平衡， 長期使用后在動物體內(nèi)殘留、并富集，直接影響了畜產(chǎn)品的品質(zhì)和間接損害人類的健康，亟 待需要安全、新型抗生素替代品來控制疾病和促進動物健康生長。
[0003] 目前，可用于飼料添加劑領(lǐng)域工業(yè)化生產(chǎn)的菌種很多，我國農(nóng)業(yè)部（2008)公布的 飼用微生物添加劑有15種。其中芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌是應(yīng)用最多的微生物添加劑菌 種。芽孢桿菌由于穩(wěn)定性好、抗逆性強、復(fù)活率高，通過與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)，抑制病原 菌;提高機體的免疫機能，并提供營養(yǎng)物質(zhì)等作用，調(diào)節(jié)消化道健康，增強動物體的免疫功 能，達到促進目標動物的生長、提尚伺料的轉(zhuǎn)化率的目的。
[0004] 白細胞介素-2( interleukin-2，IL-2)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，有以下作用： (1)活化T細胞，促進細胞因子產(chǎn)生；（2)刺激NK細胞增殖，增強NK殺傷活性及產(chǎn)生細胞因子， 誘導(dǎo)LAK細胞產(chǎn)生；（3)促進B細胞增殖和分泌抗體;（4)激活巨噬細胞。
[0005] 巨噬細胞的極化分型是按照其功能劃分的。以分泌促炎因子為主，發(fā)揮促炎功能 的巨噬細胞稱為Ml型巨噬細胞。常見的Ml型巨噬細胞的表面標志有:HLA-DR、⑶197等。Ml型 巨噬細胞在IFN-γ、LPS和TNF-α等因子作用下，發(fā)揮宿主防御功能，分泌R〇S、RNS、TNF_a、 IL-l、IL-12、IL-23和其他趨化因子，主要發(fā)揮針對微生物的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮宿主免疫功能， 也會導(dǎo)致機體正常組織的炎癥損傷。常見的M2型巨噬細胞的表面標志有:CD209、CD206和 CD301等。巨噬細胞在IL-4、IL-13、IL-10和TGF-β等作用下，向M2型極化，可分泌TGF-β、 VEGF、EGF等因子，尤其在炎癥反應(yīng)后期發(fā)揮抗炎作用，促進創(chuàng)傷修復(fù)和纖維變性。因此，維 持機體M1/M2平衡對于免疫應(yīng)答和組織損傷修復(fù)有重要意義。
[0006] 巨噬細胞激活肽調(diào)節(jié)M2型巨噬細胞向Ml型轉(zhuǎn)變，激活固有免疫，提高吞噬活性，加 速抗原提呈，促進獲得性免疫應(yīng)答，對維持M1/M2功能性平衡有著重要意義。
[0007] 文獻"IL2-GMCSF融合蛋白高效表達條件的初步研究"（《解放軍廣州醫(yī)高專利學(xué) 報》，1996,19(2))和"白細胞介素-2和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的克隆與表達"（北京 農(nóng)學(xué)院碩士論文，2008)均公開了一種IL-2和巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF的融合基因，以 大腸桿囷為宿主囷。
[0008] 上述兩篇文獻的融合基因在表達后無法在腸道自動分割為單獨的活性蛋白。腸道 黏膜層富集有大量的粒細胞與巨噬細胞，而腸系膜淋巴結(jié)富集有大量的免疫淋巴細胞，如 NK cell、T cell、B cell、樹突細胞等。文獻中的融合蛋白在腸道黏膜和腸系膜淋巴結(jié)兩個 位置無法同時行使功能并發(fā)揮作用，對疾病的治療效果不好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] Μ1型巨噬細胞激活肽不同于GMCSF (粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子），Μ1型巨噬 細胞激活肽來源于中性粒細胞分泌的cathelicidin家族蛋白的片段14個氨基酸，能激活巨 噬細胞的吞噬能力，調(diào)節(jié)Ml型巨噬細胞增殖，核心作用是抗菌肽的功能與免疫細胞活性調(diào) To
[0010] 本發(fā)明提供了一種Ml型巨噬細胞激活肽與IL-2融合蛋白、融合基因、表達載體及 其構(gòu)建方法。采用多重表達Ml型巨細胞激活肽(macrophage activate peptide，MAP): KSRIVPAIPVSLL-NH2,與IL-2基因拼接共表達，組成激活免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子。
[0011] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案：
[0012] 一種Ml型巨噬細胞激活肽與IL-2融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白的氨基酸 序列如SEQID N0:1。
[0013] 本發(fā)明的融合蛋白通過GSGDDDDK氨基酸序列鏈接Ml型巨噬細胞激活肽與IL-2， GSGDDDDK在腸道里被胰蛋白酶激酶切割成獨立的活性結(jié)構(gòu)域，利用GSG氨基酸柔性序列保 護了Ml型巨噬細胞激活肽和IL-2的獨立折疊，DDDDK氨基酸序列保障該融合蛋白能夠有效 的被小腸胰蛋白酶激酶切割識別。有效地保障了 Ml型巨噬細胞激活肽在腸黏膜層激活粒細 胞與巨噬細胞，同時，IL-2能夠通過Μ細胞調(diào)節(jié)腸系膜淋巴結(jié)(P氏小結(jié)）內(nèi)部的淋巴細胞。
[0014] 本發(fā)明的融合蛋白對PRRSV(感染巨噬細胞）以及PCV2(感染DC細胞)具有顯著治療 調(diào)節(jié)作用。復(fù)合物通過刺激Ml型巨噬細胞增殖活化，下調(diào)M2型巨噬細胞數(shù)量，有效恢復(fù)免疫 抑制。Ml型巨噬細胞上調(diào)IL-1 (協(xié)同刺激APC和T細胞活化，促進B細胞增殖和分泌抗體）、IL-12(促進DC細胞活性，輔助抗原提呈）、IL-23(促進免疫記憶細胞活性）的表達，能夠顯著增 強巨噬細胞吞噬能力，增強其胞內(nèi)溶酶體活性，促進抗原提呈，進一步促進獲得性免疫應(yīng) 答，產(chǎn)生中合性抗體。
[0015] 本發(fā)明融合蛋白中的Ml型巨噬細胞激活肽來源于中性粒細胞分泌的 cathelicidin家族蛋白的片段Innate defense regulator peptide-l(KSRIVPAIPVSLL)， 通過對其進行設(shè)計改造后為14個氨基酸:KSRIVPAIPPVSLL。改造后的氨基酸片斷增加了堿 性氨基酸(P、脯氨酸)含量，提高短肽的正電位，有利于短肽與微生物細胞膜的結(jié)合，促進短 肽對細菌和寄生蟲細胞膜的穿孔效應(yīng)，同時保障維持α-螺旋的穩(wěn)定三嵌段(親水一疏水一 親水)結(jié)構(gòu)，從而達到提高抗病原微生物的活性和細胞調(diào)節(jié)活性的目的。
[0016] 一種編碼所述Ml型巨噬細胞激活肽與IL-2融合蛋白的基因，其特征在于:所述基 因的核苷酸序列如SEQID N0:2。
[0017] 本發(fā)明的IL-2基因參照NCBI - gene bank數(shù)據(jù)庫的基因序列（GenBank: JN85 1 82 1 . 1 )。該融合基因能實現(xiàn)融合基因的高效表達，帶有自動分割位點 GGATCCGGAGATGACGATGACAAG，通過自動分割位點的堿基片斷連接Ml型巨噬細胞和IL-2的基 因序列，表達后的融合蛋白在腸道里被胰蛋白酶激酶切割成獨立的活性結(jié)構(gòu)域。
[0018]本發(fā)明還提供了包含所述編碼融合基因的表達載體，優(yōu)選地為分泌性表達載體。 分泌性表達載體在MCS位點前面有分泌信號肽序列；分泌信號肽能高效的將重組蛋白分泌 到胞外。其他載體不具備分泌等功能。
[0019] 進一步優(yōu)選地，所述的分泌性表達載體為枯草芽孢桿菌表達載體PHT43或者 pNZ8148 WHT43允許在細胞質(zhì)中高水平表達重組蛋白，pHT43載體引導(dǎo)重組蛋白到培養(yǎng)基。 這個載體基于強σΑ-依賴性啟動子的枯草桿菌groE操縱子通過添加 lac操縱子改造成為一 種高效可控的（IPTG誘導(dǎo)的）啟動子。
[0020] 本發(fā)明還提供了包含所述表達載體的融合基因工程菌，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌或者 乳酸菌。將融合表達基因與可分泌載體共同構(gòu)建的工程菌具有更好的免疫調(diào)節(jié)潛能。
[0021] 進一步優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌的菌株為BS. 168。
[0022] 本發(fā)明的融合基因?qū)倚蟮募毦愿篂a具有高效治療效用，對慢性病毒性感染疾 病有快速緩解作用，促進腸道健康，提高料肉比10%;對家禽的產(chǎn)氣莢膜梭菌有抑制作用， 治療腹瀉，抑制球蟲病，促進產(chǎn)蛋光滑，促進腸道健康，提高料肉比和產(chǎn)蛋率。
[0023]本發(fā)明Ml型巨噬細胞激活肽與IL-2融合基因表達載體的構(gòu)建方法，具體步驟如 下：
[0024] 1)PCR擴增融合基因，得到融合基因擴增片段；
[0025] 2)采用雙酶切法，雙酶切載體與擴增后的片段，采用T4連接酶將雙酶切后的產(chǎn)物 連接到質(zhì)粒；
[0026] 3)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得陽性克隆子，提取質(zhì)粒，測序驗證后，得到所述融 合基因的表達載體。
[0027]優(yōu)選地，所述的載體為pHT43,擴增引物如下：
[0028] 上游引物：AAAACATCAGCCGTAGGA-AAGTCTGTATTGTCCCTG;
[0029] 下游引物：TCCGGCTGCCCCGGG-AGTCAGTGTTGAGTAG 〇
[0030] 上述引物與目的基因互補，提供限制性內(nèi)切酶的保護信號；且與克隆載體具有 15bp-l 8bp同源序列，可以更方便