產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]L-抗壞血酸(即維生素C，VC)是一種人體自身不能合成但在體內(nèi)發(fā)揮重要生理作用的水溶性維生素?？捎脕矸乐箟难。龠M(jìn)傷口愈合;還可作為還原劑，紫外線吸收劑和黑色素形成抑制劑用于化妝品中。但位于2位碳的羥基極不穩(wěn)定，導(dǎo)致VC還原性強(qiáng)，極不穩(wěn)定，易被熱和氧化劑破壞，尤其是光，重金屬等物質(zhì)能促進(jìn)其氧化，使其在應(yīng)用方面收到限制。
[0003]2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)是一種L-抗壞血酸的衍生物，是由日本林原生物化學(xué)研究所與同山大學(xué)藥學(xué)系共同發(fā)現(xiàn)的，可作為美白劑添加到化妝品中，且由于VC分子上的C-2羥基被葡萄糖苷所取代，其C-2位上有葡萄糖基掩蔽，故其具有較高的穩(wěn)定性和抗氧化性，是良好的VC替代品。
[0004]用于催化VC生成AA-2G的酶有以下五大類，分別為環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶，a-淀粉酶，蔗糖磷酸酶，a-異麥芽糖基葡糖基形成酶，a-葡糖苷酶。其中最具工業(yè)化前景的兩種酶為環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶和a-異麥芽糖基葡糖基形成酶，使用環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的最多。a-異麥芽糖基葡糖基形成酶因其酶表達(dá)量很低，不利于AA-2G的生成，因此一般要和環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶一起使用。環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的主要來源是細(xì)菌Bacillus和KlebsielI屬。該酶最大的優(yōu)勢(shì)為轉(zhuǎn)化效率較高，但在反應(yīng)過程中會(huì)生成中間產(chǎn)物AA-2Gs，故需要進(jìn)一步利用葡糖淀粉酶將其水解為AA-2G，但目前CGTase的酶活比較低，相關(guān)文獻(xiàn)中Peanibacillus macerans產(chǎn)出的CGTase胞內(nèi)酶活水平在0.8U/mg DCW左右。
[0005]E.coli具有遺傳背景清楚、生長(zhǎng)速度快、成本低、表達(dá)量高、操作簡(jiǎn)單、表達(dá)產(chǎn)物易純化等優(yōu)點(diǎn)，是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早和目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。然而，由于E.coli過高的表達(dá)水平以及缺乏真核生物的蛋白加工體系，容易導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的蛋白聚集形成包涵體，產(chǎn)生沒有活性的酶。常用的促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)的方法有降低蛋白合成速度，如降低誘導(dǎo)溫度;優(yōu)化培養(yǎng)條件，如優(yōu)化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)時(shí)間；利用分子伴侶和折疊酶等輔助蛋白共表達(dá)等。通過以上方法，均可有效提尚蛋白可溶性表達(dá)，從而提尚酶活。
[0006]分子伴侶的概念是由Lasky在1978年首先提出的，他將細(xì)胞核內(nèi)能與組蛋白結(jié)合并介導(dǎo)核小體有序組裝的核質(zhì)素稱為分子伴侶。根據(jù)ELLis的定義及后續(xù)研究，分子伴侶概念延伸為:它們結(jié)合并穩(wěn)定其它蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，通過可調(diào)控的結(jié)合和釋放，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正確折疊、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、寡聚體組裝、蛋白與細(xì)胞內(nèi)其它組分的相互作用、有活性和無活性蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)換、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)以及蛋白質(zhì)降解;并且當(dāng)?shù)孜锏鞍谆謴?fù)到正確的天然結(jié)構(gòu)并發(fā)揮正常生理功能時(shí)，分子伴侶不再與底物蛋白結(jié)合。DnaK屬于Hsp70家族，其輔助伴侶為DnaJ(屬于Hsp40家族)和核苷酸交換因子GrpE。部分科學(xué)家認(rèn)為，DnaK的結(jié)合能使去折疊蛋白保持在可折疊狀態(tài)。當(dāng)去折疊蛋白從DnaK解離后，一部分能夠自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。而另一部分折疊緩慢的中間體能反復(fù)被Hsp70系統(tǒng)結(jié)合與釋放，從而阻止肽鏈中間體的錯(cuò)誤聚集，促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊。經(jīng)過該系統(tǒng)后，將有5-18%的蛋白質(zhì)折疊為天然結(jié)構(gòu)。GroEL屬于伴侶蛋白，其輔助伴侶為GroES。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)翻譯完成后，利用DnaK系統(tǒng)不能實(shí)現(xiàn)正常折疊的蛋白將被轉(zhuǎn)移至伴侶蛋白。故可將分子伴侶和含目的基因的質(zhì)粒一起導(dǎo)入，有效地使蛋白正確折疊，從而提高酶活。
[0007]目前，在生產(chǎn)AA-2G方面，日本林原公司在市場(chǎng)上占有壟斷地位。AA-2G的價(jià)格是VC的100多倍，可見其具有較高的市場(chǎng)價(jià)值，但在我國(guó)，對(duì)于生產(chǎn)AA-2G的研究尚在初步探究的階段，還未達(dá)到工業(yè)化的水平，并且其后的分離提純工藝也需耗費(fèi)人力物力，有效提高轉(zhuǎn)化率，節(jié)約生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝也是當(dāng)務(wù)之急。
[0008]在糖基供體的選擇中，α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率高，但其價(jià)格較為昂貴，不適合工業(yè)化生產(chǎn)使用;環(huán)糊精溶解性較低，轉(zhuǎn)化率略低，但價(jià)格便宜；其余的糖基供體轉(zhuǎn)化率很低。因此，本發(fā)明過程后期的轉(zhuǎn)化過程選用環(huán)糊精作為糖基供體，由于其溶解性低，故采用多次分批添加β-環(huán)糊精，提高AA-2G的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提高環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的酶活，提供一種產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌及其應(yīng)用。
[0010]—種產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌，該基因工程菌是將環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因通過載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中得到的，其可將產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶留在細(xì)胞內(nèi)；其中所述的載體為質(zhì)粒載體pET28a。
[0011 ] 所述宿主細(xì)胞中導(dǎo)入有含分子伴侶Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的質(zhì)粒PGKJE8。
[0012]所述的基因工程菌的制備方法，包括如下步驟:
1)將質(zhì)粒PGKJE8轉(zhuǎn)入感受態(tài)宿主細(xì)胞中，挑選出轉(zhuǎn)化菌株，制成感受態(tài)細(xì)胞；
2)將環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因?qū)氲劫|(zhì)粒載體pET28a中，構(gòu)建得到pET28a-cgt表達(dá)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，通過選擇培養(yǎng)基挑選得到基因工程菌。
[0013]所述的基因工程菌在產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用，包括如下步驟:
1)將基因工程菌接種至種子培養(yǎng)基，進(jìn)行種子培養(yǎng)；
2)將步驟I)培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2-8h，加IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)至24h，停止發(fā)酵，離心，棄上清，用磷酸緩沖液重懸，超聲，獲得環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶粗酶液。
[0014]為了進(jìn)一步提高酶活，本發(fā)明優(yōu)化了培養(yǎng)條件，
IPTG 濃度為 0.0 ImM-0.4mM。
[0015]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源濃度為5_30g/L，優(yōu)選為15g/L。
[0016]所述的碳源可以為葡萄糖或者麥芽糖，優(yōu)選為麥芽糖。
[0017]所述的基因工程菌在產(chǎn)2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸中的應(yīng)用。
[0018]所述環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶來源于嗜堿性軟化類芽孢桿菌(PeanibaciIlusmacerans ) ,GenBank登錄號(hào)為X59045，優(yōu)化密碼子后人工合成得到環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因cgt。
[0019]所述宿主細(xì)胞可以為細(xì)菌或真菌細(xì)胞。
[0020]基因工程菌的構(gòu)建方法:將環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因連接到質(zhì)粒pET_28a上，得到包含環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的重組質(zhì)粒pET28a-cgt，然后將重組質(zhì)粒pET28a-cgt轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3 )中，得到重組菌BL21 -pET28a_cgt。
[0021]包含有分子伴侶的基因工程菌的構(gòu)建方法:將質(zhì)粒pG_KJE8(購(gòu)自Takara，含分子伴侶Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL)轉(zhuǎn)入E.Coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，將攜有分子伴侶質(zhì)粒的菌株E.Coli BL21-pGKJE8制備成感受態(tài)細(xì)胞；將構(gòu)建好的pET28a_cgt表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.Coli BL21-pGKJE8感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建出BL21-pGKJE8-pET28a-cgt菌株。所述菌株將含有分子伴侶Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的質(zhì)粒pGKJE8和pET28a_cgt—并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，可以有效提尚蛋白的正確折置率，從而減少包涵體的形成，提尚酶的正確表達(dá)率，提尚酶活。
[0022]所述含環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因?qū)氲妮d體為PET28a，使酶留在細(xì)胞內(nèi)，便于酶液的保存，同時(shí)也有利于酶液濃縮。
[0023]本發(fā)明應(yīng)用于AA-2G的生產(chǎn)，反應(yīng)底物為L(zhǎng)-抗壞血酸和β-環(huán)糊精，環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶酶量為50U/mL-200U/mL，溫度為30-45°C，pH為4.0-6.0，反應(yīng)時(shí)間20_28h，而后加入糖化酶35-55 °C反應(yīng)20-28h。
[0024]有益效果:本發(fā)明構(gòu)建了產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌，該菌株能夠使酶留在胞內(nèi)，便于保存濃縮。優(yōu)化了菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件，利用麥芽糖為碳源，培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，且有利于酶活的提高，使酶活由0.61U/mg DCW提高到2.0OU/mg DCW。優(yōu)選的構(gòu)建了含有分子伴侶的菌株，可以有效減少包涵體的形成，使錯(cuò)誤折疊的蛋白重新正確折疊，從而有效地提高酶活。酶活可由原始菌株的2.0OU/mg DCW提高到7.82U/mg DCW。通過酶活的提高可以有效提高2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸產(chǎn)量。
[0025]具體實(shí)施案例
以下實(shí)施例中采用的環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因是:根據(jù)來源于嗜堿性軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans )的環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(GenBank登錄號(hào)為X59045)進(jìn)行密碼子優(yōu)化人工合成得到環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因，基因序列如SEQ.N0.1所示。
[0026]實(shí)施例1菌株的構(gòu)建
pET28a-cgt表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:采用化學(xué)合成法合成環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列cgt。用于構(gòu)建大腸桿菌的質(zhì)粒是pET28a，帶有T7啟動(dòng)子。將pET28a的質(zhì)粒用XhoI和BamHI雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收。對(duì)含有cgt基因的質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR，引物如下:
正向引物5 ’ -CAGCAAATGGGTCGCGGATCCAGTCCTGACACCAGCGTGG-3 ’
PCR 條件:94°C 預(yù)變性 5min;隨后 30 個(gè)循環(huán)(94°C45s，57°C45s，72°C2min30s);72°C 再延伸1min0
[0027]進(jìn)行膠回收，將膠回收好的PCR過的基因與膠回收好的酶切過的質(zhì)粒一步克隆，轉(zhuǎn)化入BL2UDE3)中，轉(zhuǎn)化的具體步驟如下:將裝有200μ1制作好的感受態(tài)細(xì)胞冰盒上解凍5-1Omin ；加入20μ1冷卻的一步克隆反應(yīng)液;手指輕彈，混勻，冰上放置30min; 42°C，水浴90s，冰浴2min;加入900ylLB培養(yǎng)基，復(fù)蘇細(xì)胞，37°C，200rpm，培養(yǎng)lh。取ΙΟΟμΙ涂布在抗性平板上，37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，長(zhǎng)出的菌即為轉(zhuǎn)化成功的菌株。經(jīng)37 0C培養(yǎng)過夜后，進(jìn)行轉(zhuǎn)點(diǎn)，提取質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證，得到的菌BL21-pET28a-cgt中成功轉(zhuǎn)化有表達(dá)質(zhì)粒pET28a-cgt。
[0028]實(shí)施例2
分子伴侶共表達(dá)體系的構(gòu)建步驟如下:
步驟1:制備E.Co I i BL21感受態(tài)細(xì)胞(在無菌條件下操作):將BL21菌體加入5ml的LB試管中，37°(:，200印111，培養(yǎng)1211;取11111菌液接種到10011111^搖瓶中，37°(:，200印111，培養(yǎng)至00600=
0.5-0.6，冰上放置101