鹿血清的分離制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種鹿血清的生產(chǎn)工藝，尤其涉及一種鹿血清的分離制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前細(xì)胞培養(yǎng)工藝與方法已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、醫(yī)療、生物工程、基因工程、疫苗生 產(chǎn)等領(lǐng)域，其中細(xì)胞培養(yǎng)液在生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)和研究中成為無可替代的生物材料。當(dāng) 前國內(nèi)市場(chǎng)上所流通的細(xì)胞培養(yǎng)液，主要為含小牛血清或胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，以及一 些無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。其中所使用的牛血清絕大部分來自澳大利亞、新西蘭等國，而國內(nèi) 的牛血清來源主要集中在市場(chǎng)底端，原料大多來自于屠宰牛血。
[0003] 近幾年世界上發(fā)生瘋牛病事件后，從根源上對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液產(chǎn)業(yè)形成了結(jié)構(gòu)性的影 響和沖擊，尤其是如果在細(xì)胞培養(yǎng)液中檢出瘋牛病毒會(huì)產(chǎn)生極其嚴(yán)重的后果。當(dāng)前市場(chǎng)上 在醫(yī)藥、醫(yī)療、生物材料，基因工程、疫苗生產(chǎn)等領(lǐng)域，所使用的以牛源血清為基礎(chǔ)的各種細(xì) 胞培養(yǎng)基面對(duì)瘋牛血可能會(huì)發(fā)生流行的風(fēng)險(xiǎn)是客觀的，因此需要更安全的細(xì)胞培養(yǎng)液來替 代牛源血清細(xì)胞培養(yǎng)液。但由于用于珍貴細(xì)胞培養(yǎng)的血清培養(yǎng)基大多從國外進(jìn)口，價(jià)格比 較昂貴，給使用單位造成較大的成本負(fù)擔(dān)。因此在上述背景情況下，如何提供一種直接取代 小牛血清、胎牛血清的動(dòng)物血清成為當(dāng)前細(xì)胞培養(yǎng)液技術(shù)領(lǐng)域的一大重要課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中出現(xiàn)的問題，本發(fā)明提供了一種鹿血清的分離制備方 法，該制備方法簡(jiǎn)便快捷，工藝穩(wěn)定且適于大批量生產(chǎn)，且所得鹿血清能夠用于含血清細(xì)胞 培養(yǎng)液的制備。
[0005] 本發(fā)明為了解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0006] -種鹿血清的分離制備方法，包括下述步驟：
[0007] (1)采血:將待采血鹿采用消毒液進(jìn)行鹿體全身清潔消毒處理后，無菌采血法采取 鹿全血至離心瓶內(nèi)，將離心瓶置于4~5 °C下恒溫靜置5~6h;
[0008] (2)分離:將經(jīng)（1)處理后的鹿全血在4~5°C的條件下，采用2000~3000rpm的轉(zhuǎn)速 離心40~50min，離心結(jié)束后在真空環(huán)境下從離心瓶中抽取血清，將該抽取所得的血清置 于-25~-30°C下保存?zhèn)溆?，得到冷凍的血清?br>[0009] (3)去除纖維蛋白：將經(jīng)(2)處理所得的冷凍血清置于4~5°C環(huán)境中融化，將融化 后所得血清通過多層無菌紗布過濾，收集濾液；
[0010] (4)滅活:將經(jīng)(3)處理所得濾液置于56~60 °C下恒溫水浴30~40min，水浴過程中 隨時(shí)晃動(dòng)濾液；
[0011] (5)降低IgG濃度和葡萄糖含量:將經(jīng)(4)處理后的濾液采用層析法將IgG濃度降低 至小于5μg/ml;然后采用能夠透析蛋白分子量為12000~14000的透析膜于0.15~0.18mol/ L的NaCl水溶液中透析至葡萄糖含量小于0.5mg/ml;
[0012] (6)去除病毒和支原體及除菌過濾:將經(jīng)（5)處理后的血清采用劑量為30~45KGy 的γ射線照射;然后將上述血清裝入連續(xù)流血漿滅菌器內(nèi)，并用紫外線以45~50°照射該裝 有血清的連續(xù)流血漿滅菌器，照射同時(shí)將血清通過ΕΚ級(jí)無石棉蔡氏濾片得到濾液，然后再 將該濾液通過〇. 22~0.25μπι過濾膜過濾，最后經(jīng)100~150nm過濾膜過濾，得到鹿血清。
[0013] 其進(jìn)一步的技術(shù)方案是：
[0014] 步驟（1)中待采血鹿為身體狀況健康、精神狀態(tài)良好、無疫情史的成年鹿、小鹿和 胎鹿中的一種。
[0015] 步驟（1)中采用2wt. %碘酒和75vol. %酒精作為消毒液依次對(duì)待采血鹿進(jìn)行鹿體 全身清潔消毒。
[0016] 步驟(3)中采用八層無菌紗布對(duì)融化所得血清進(jìn)行過濾。
[0017] 步驟⑷中將濾液置于56 °C下恒溫水浴30min。
[0018] 步驟(6)中所述連續(xù)流血漿滅菌器的流速為250-270mL/min。
[0019] 本發(fā)明還公開了一種上述分離制備方法制備所得的鹿血清。
[0020] 本發(fā)明還公開了由上述制備方法制備所得的鹿血清在含血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的應(yīng) 用。
[0021] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明所述制備方法簡(jiǎn)便快捷，工藝穩(wěn)定且適于大批 量生產(chǎn)，且所得鹿血清不含纖維蛋白，IgG濃度和葡萄糖含量低，能夠徹底杜絕病毒、病菌和 支原體的污染，制備所得的鹿血清能夠用于含血清細(xì)胞培養(yǎng)液的制備。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。下述具體實(shí)施例中選用未進(jìn) 食的新生梅花鹿，并檢查鹿體檔案:包括母系年齡、體重、健康狀況、精神狀況、近1年有無疫 情、近1年的疫苗注射情況，并將上述內(nèi)容登記入待采血鹿的血液檔案。
[0023] 具體實(shí)施例一
[0024] (1)采血：將上述選擇好的待采血鹿依次采用濃度為2wt. %的碘酒和濃度為 75vol. %的酒精對(duì)鹿體進(jìn)行全身清潔消毒處理，處理結(jié)束后，使用無菌采血針從清潔消毒 后鹿體的靜脈進(jìn)行全血采集，并將采集到的全血存放在離心瓶中并于4°C下靜置6h;
[0025] (2)分離：將經(jīng)（1)處理后的鹿全血在4°C的條件下，采用2000rpm的轉(zhuǎn)速離心 50min，離心結(jié)束后在真空環(huán)境下從離心瓶中抽取血清，將該抽取所得的血清置于-25°C下 保存?zhèn)溆茫玫嚼鋬龅难澹?br>[0026] (3)去除纖維蛋白：將經(jīng)(2)處理所得的冷凍血清置于4°C的冰箱中進(jìn)行融化，將融 化后所得血清通過八層無菌紗布過濾去除纖維蛋白，收集濾液；
[0027] (4)滅活:將經(jīng)(3)處理所得濾液置于56°C下嚴(yán)格控制水溫條件下恒溫水浴40min， 水浴過程中隨時(shí)晃動(dòng)濾液保持其濾液均勻，避免濾液產(chǎn)生沉淀；
[0028] (5)降低IgG濃度和葡萄糖含量:將經(jīng)(4)處理后的濾液采用目前常規(guī)使用的層析 法將IgG濃度降低至小于5μg/ml;然后采用能夠透析蛋白分子量為12000的透析膜于 0.15mol/L的NaCl水溶液中透析至葡萄糖含量小于0.5mg/ml;
[0029] (6)去除病毒和支原體及除菌過濾:將經(jīng)(5)處理后的血清采用劑量為30KGy的γ 射線照射;然后將上述血清裝入連續(xù)流血漿滅菌器內(nèi)并以45°角度采用紫外線照射，其中連 續(xù)流血漿滅菌器的流速為250mL/min，照射同時(shí)將血清通過ΕΚ級(jí)無石棉蔡氏濾片得到濾液， 將該濾液通過ο. 22μπι過濾膜過濾后，再經(jīng)過lOOnm過濾膜過濾，得到鹿血清樣品1。將上述制 備所得的鹿血清保存在-20 °C的冰箱中冷凍保存。
[0030] 具體實(shí)施例二
[0031 ] (1)采血：將上述選擇好的待采血鹿依次采用濃度為2wt. %的碘酒和濃度為 75vol. %的酒精對(duì)鹿體進(jìn)行全身清潔消毒處理，處理結(jié)束后，使用無菌采血針從清潔消毒 后鹿體的靜脈進(jìn)行全血采集，并將采集到的全血存放在離心瓶中并于5°C下靜置5h;
[0032] (2)分離：將經(jīng)（1)處理后的鹿全血在5°C的條件下，采用3000rpm的轉(zhuǎn)速離心 40min，離心結(jié)束后在真空環(huán)境下從離心瓶中抽取血清，將該抽取所得的血清置于-30°C下 保存?zhèn)溆?，得到冷凍的血清?br>[0033] (3)去除纖維蛋白：將經(jīng)(2)處理所得的冷凍血清置于5°C的冰箱中進(jìn)行融化，將融 化后所得血清通過八層無菌紗布過濾去除纖維蛋白，收集濾液；
[0034] (4)滅活:將經(jīng)(3)處理所得濾液置于60°C下嚴(yán)格控制水溫條件下恒溫水浴30min， 水浴過程中隨時(shí)晃動(dòng)濾液保持其濾液均勻，避免濾液產(chǎn)生沉淀；
[0035] (5)降低IgG濃度和葡萄糖含量:將經(jīng)(4)處理后的濾液采用目前常規(guī)使用的層析 法將IgG濃度降低至小于5μg/ml;然后采用能夠透析蛋白分子量為14000的透析膜在于 0.18mol/L的NaCl水溶液中透析至葡萄糖含量小于0.5mg/ml;
[0036] (6)去除病毒和支原體及除菌過濾:將經(jīng)(5)處理后的血