一種以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導(dǎo)劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法
【專利說明】一種以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導(dǎo)劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地涉及纖維素酶的生產(chǎn)方法。以黑曲霉為菌種，葡萄糖為碳源，添加纖維素酶誘導(dǎo)劑，液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是一類能將纖維素水解成葡萄糖的生物酶，纖維素酶屬于誘導(dǎo)酶，產(chǎn)纖維素酶的微生物必須在環(huán)境中存在纖維素類底物的條件下才會(huì)合成纖維素酶。目前工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶的方法是通過在纖維素類介質(zhì)上培養(yǎng)能合成纖維素酶的微生物，主要是黑曲霉、木霉和青霉等霉菌，這些霉菌在生長過程中由細(xì)胞內(nèi)合成纖維素酶并分泌至細(xì)胞外。天然纖維素類介質(zhì)不溶于水，工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶往往采用固態(tài)發(fā)酵工藝，但是固態(tài)發(fā)酵很多發(fā)酵參數(shù)不易自動(dòng)化控制。
[0003]很多科學(xué)研究結(jié)果表明，天然纖維素是大分子物質(zhì)，不能直接進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)部誘導(dǎo)細(xì)胞組件合成纖維素酶，真正發(fā)揮“誘導(dǎo)”作用的物質(zhì)是纖維素或半纖維素在細(xì)胞外經(jīng)水解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，如二糖和寡糖等，這些小分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)過進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化形成了纖維素酶的合成因子。
[0004]竹筍殼中含有大量的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，以竹筍殼作為主要成分制作栽培料栽培平菇，平菇菌絲產(chǎn)生豐富的胞外水解酶分解纖維素和半纖維素，平菇成熟采摘后剩余的栽培料稱為“菇渣”，菇渣中仍然含有很多纖維素酶的合成因子，這些合成因子經(jīng)抽提分離后可以用來作為纖維素酶的誘導(dǎo)劑。
[0005]葡萄糖是發(fā)酵工程中的速效碳源，產(chǎn)纖維素酶的微生物可以利用葡萄糖作基質(zhì)快速生長繁殖，但是葡萄糖也是一種纖維素酶合成的抑制劑，葡萄糖分子抑制了微生物細(xì)胞內(nèi)纖維素酶合成因子的生成，所以當(dāng)培養(yǎng)基中存在葡萄糖時(shí)，微生物的個(gè)體生長很快但不能合成纖維素酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了使產(chǎn)纖維素酶的微生物能在液態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)中既快速生長繁殖又高效合成纖維素酶，本發(fā)明提供一種以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導(dǎo)劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法。
[0007]本發(fā)明通過改進(jìn)葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，在葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中添加纖維素酶合成因子作誘導(dǎo)劑，在發(fā)酵過程中微生物個(gè)體既可以快速生長繁殖又可以高效的合成纖維素酶，同時(shí)提升農(nóng)副殘余的綜合利用價(jià)值。
[0008]具體的技術(shù)解決方案如下:
一種以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導(dǎo)劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的操作步驟如下:
(I)用竹筍殼制作誘導(dǎo)劑
(1.1)按重量比4:1將竹筍殼干粉和麩皮混和，加水拌勻、滅菌，制成發(fā)酵底料；
(1.2)在發(fā)酵底料中接入平菇菌種，好氧固態(tài)發(fā)酵，當(dāng)菌絲長密長實(shí)，發(fā)酵完成;發(fā)酵底料中的竹筍殼干粉被部分降解，成為平菇發(fā)酵料；
(1.3)將平菇發(fā)酵料烘干至恒重，粉碎，得到纖維素酶誘導(dǎo)粉劑；
(1.4)將纖維素酶誘導(dǎo)粉劑和自來水混和，加熱，沸水浸提，靜置冷卻，取上層清液蒸發(fā)濃縮制成纖維素酶誘導(dǎo)水劑；
(2)配制霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方如下:
葡萄糖2.0 g、氯化鈉(NaCl)0.05 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.1 g、七水硫酸鎂(MgSO4.7_0.05 g、硫酸銨((NH4)2S04) 0.2 g、纖維素酶誘導(dǎo)水劑10 mL和水90 mL；
(3)霉菌好氧發(fā)酵
在霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入黑曲霉孢子懸液，好氧恒溫發(fā)酵，得到發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵液后處理
將發(fā)酵液經(jīng)過濾或離心處理，分離出其中的菌絲球，所得清液中纖維素酶活不低于4U/mL，將清液濃縮制成纖維素酶濃縮液或凍干制成纖維素酶粉劑。
[0009]進(jìn)一步限定的技術(shù)方案如下:
步驟(1.1)中竹筍殼干粉過40目篩，按重量比4:1將竹筍殼干粉和麩皮混和，再加入干物質(zhì)重量2倍的自來水拌勻。
[0010]步驟(1.2)中接種量為發(fā)酵底料重量的5%，溫度28±2°C條件下，培養(yǎng)15d。
[0011 ]步驟(1.3)中將平菇發(fā)酵料在80°C溫度下烘干。
[0012]步驟(1.4)中纖維素酶誘導(dǎo)粉劑和自來水混和的比例是重量比1:10，沸水浸提20min，蒸發(fā)濃縮制成纖維素酶誘導(dǎo)水劑的體積是原液體積的1/10。
[0013]步驟(3)中霉菌好氧發(fā)酵的工藝條件:搖瓶發(fā)酵時(shí)，100mL霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入濃度(1.10?1.20) X 16個(gè)/mL的I mL黑曲霉孢子懸液，恒溫?fù)u床培養(yǎng);轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度32 °C、發(fā)酵時(shí)間72 h。
[0014]步驟(3)中霉菌好氧發(fā)酵的工藝條件:5L發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，2 L霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入濃度(1.10?1.20) X 1fMVmL的20 mL黑曲霉孢子懸液，攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min、通氣量0.5 L/min、溫度32°C、發(fā)酵時(shí)間72 h。
[0015]步驟(4)中處理清液的具體制劑方法是:-40°C真空冷凍干燥48h，制成纖維素酶粉劑;或室溫下真空杯過濾濃縮，濾膜透過分子量小于500 Da，制成纖維素酶濃縮液。
[0016]本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面:
1.在培養(yǎng)基中不含纖維素類物質(zhì)的情況下，實(shí)現(xiàn)了纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)。
[0017]2.本發(fā)明提高了竹筍的綜合利用價(jià)值，竹筍可以制作成多種類型的食品，竹筍加工的殘余一一竹筍殼，可以用來栽培平菇，平菇采摘后的菇渣，可以繼續(xù)用于生產(chǎn)纖維素酶，這種對(duì)竹筍的綜合利用為農(nóng)產(chǎn)品深加工提供了一種新模式。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0019]本發(fā)明所用黑曲霉菌種購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，拉丁學(xué)名分別為Aspergillus nigerD
[0020]實(shí)施例1
以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導(dǎo)劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的具體操作步驟如下: 1.制作纖維素酶誘導(dǎo)粉劑
1.1將竹筍殼沖洗干凈，600C烘箱中烘干，粉碎，過40目篩得竹筍殼干粉，取1g竹筍殼干粉和2.5 g麩皮混和，再加入25 mL自來水，拌勻，裝入250 mL錐形瓶中121°C高壓蒸汽滅菌60 min，冷卻，得到發(fā)酵底料；
1.2.平菇發(fā)酵降解竹筍殼
在發(fā)酵底料中接入2g平菇菌種，溫度30°C、濕度70%條件下，培養(yǎng)15 d，當(dāng)菌絲長密長實(shí)，發(fā)酵完成;發(fā)酵底料中的竹筍殼被部分降解，成為平菇發(fā)酵料；
1.3.平菇發(fā)酵料后處理
將平菇發(fā)酵料打散，80 °C烘干，粉碎，制得纖維素酶誘導(dǎo)粉劑；
2.制作竹筍殼降解產(chǎn)物的水浸提液
稱取1g纖維素酶誘導(dǎo)粉劑于大燒杯中，加入1000 mL的自來水，電爐加熱至沸騰，保持微沸30 min，期間每隔5 min攪拌一次，然后靜置、冷卻，取上清液300 mL，分裝入3只250 mL的錐形瓶，每瓶100 mL上清液。
[0021 ] 3.配制霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基
在100 mL的上清液中加入如下物質(zhì):2.0g葡萄糖，0.05g氯化鈉(NaCl)，0.1g磷酸二氫鉀(KH2P04)