一種產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選方法及其發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選方法及其發(fā)酵生 產(chǎn)纖維素酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 木質(zhì)纖維類物質(zhì)是地球上分布最廣、儲藏最豐富的物質(zhì)，也是最廉價的可再生資 源。纖維素酶則是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協(xié)同作用，將 纖維素降解產(chǎn)生寡糖和纖維二塘，最終水解為葡萄糖、木糖等單糖，進(jìn)而可進(jìn)一步制取酒 精、食品、單細(xì)胞蛋白、醫(yī)藥品及其他化學(xué)化工原料。因此，纖維素酶在燃料乙醇制取、造紙、 飼料加工等行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景。
[0003]纖維素酶的產(chǎn)生菌包括細(xì)菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纖維素酶生產(chǎn)的菌 種主要為絲狀真菌。絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶酶系較全，且其產(chǎn)生的酶多為胞外酶，便于后 期的分離提取。纖維素酶是由三種不同的酶組成的多酶復(fù)合物:外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖 酶和葡萄糖苷酶(BGL)，三種酶協(xié)同作用完成對纖維素的水解。
[0004]目前纖維素酶的應(yīng)用依然在一定程度上受限于居高不下的生產(chǎn)成本問題。纖維素 酶高生產(chǎn)成本問題主要表現(xiàn)為以下兩個方面:其一，纖維素酶的產(chǎn)生菌株的發(fā)酵酶活力相 對較低，一直是大規(guī)模生產(chǎn)急需解決的問題，也是長期制約纖維素酶大量生產(chǎn)并限制其應(yīng) 用的主要因素;其二，目前使用的絲狀真菌由于菌種特性和培養(yǎng)條件等因素使得纖維素酶 發(fā)酵時間普遍較長，成本過高。目前關(guān)于纖維素酶生產(chǎn)和研究的絲狀真菌主要有木霉屬、曲 霉屬和青霉屬微生物，發(fā)酵周期一般在6d以上，具有耗時長、效率低等特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對以上不足，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)纖維素酶的菌株的篩選方法，所述菌株是從 黃山生態(tài)林腐木中通過初篩、原生質(zhì)體制備、紫外光照誘變選育、復(fù)篩得到的一種名稱為 TP-02的產(chǎn)纖維素酶的菌株。
[0006] 本發(fā)明還提供了通過上述篩選方法篩選得到的菌株作為生產(chǎn)維素酶的應(yīng)用。此菌 株具備高產(chǎn)纖維素酶的能力，可以豆柏、硫酸銨、尿素或氯化銨為氮源，以麩皮汁、乳糖、淀 粉糖、稻草秸桿或玉米秸桿為碳源經(jīng)液態(tài)發(fā)酵，在培養(yǎng)72~84小時后，其濾紙酶活力可達(dá)到 16.98IU/mL，內(nèi)切酶酶活達(dá)到41.33IU/mL，外切酶酶活達(dá)到3.65IU/mL，i3-葡聚糖苷酶酶活 力達(dá)到 15.98IU/mL。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種維素酶的生產(chǎn)方法，該方法相對于其他現(xiàn)有技術(shù)，其發(fā)酵產(chǎn) 酶周期大大縮短。
[0008] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0009] -種產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟:初篩、原生質(zhì)體制 備、紫外光照誘變選育、復(fù)篩；
[0010] 所述產(chǎn)纖維素酶菌株已于2015年7月16日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生 物研究所；保藏編號為CGMCC心.11119;分類命名為葡枝根霉點頭變種仙^〇?1^ stolonifer var.reflexus〇
[0011] 所述篩選方法具體包括以下步驟：
[0012] A.初篩培養(yǎng)基初篩，所述初篩培養(yǎng)基的成分為:每L培養(yǎng)基含有:CMC-Na 5-10g;葡 萄糖 3-5g;瓊脂 10_2(^;1&111(1615無機(jī)營養(yǎng)鹽100〇1111^
[0013] B.制備原生質(zhì)體，將初篩得到的菌株的孢子于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)純化、離心后 獲得的菌絲于破壁液中振蕩孵育，過濾、離心純化后得到原生質(zhì)體;所述破壁液的成分為蝸 牛酶:纖維素酶= 3:1;
[0014] C.誘變選育，將步驟B得到的原生質(zhì)體用15W紫外燈照射進(jìn)行誘變處理，處理液涂 布于高滲初篩培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后菌落轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)；
[0015] 所述高滲初篩培養(yǎng)基平板的成分為:每L培養(yǎng)基含有:CMC-Na 5-10g;葡萄糖3-5g; 瓊脂10-20g; Mandel S無機(jī)營養(yǎng)鹽1000mL; KC1 0.6mo 1;使用高滲初篩培養(yǎng)基平板可以維持 合適的生理滲透壓，避免原生質(zhì)體破碎。
[0016] D.復(fù)篩;將步驟C得到的TOA斜面培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物的孢子懸液接種于液態(tài)種子培 養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將種子培養(yǎng)液按1:10體積比接種到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過對發(fā)酵產(chǎn)物 酶解還原糖產(chǎn)量的測定，篩選出酶活性高的菌株，即為產(chǎn)纖維素酶菌株TP-02。
[0017] 所述液態(tài)種子培養(yǎng)基的成分為：10%麩皮浸出汁，其制備方法為稱取100g麩皮，加 入800mL蒸餾水煮沸30min，4層紗布過濾，定容至1000mL。
[0018]所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:每L培養(yǎng)基含有:80~120目的玉米猜桿、稻草或麥 桿5-10g，5%麩皮浸出汁80_100g，（NH4)2S〇4 2〇-30g，KH2P〇4 5-10g，MgS〇4.7H20 5-10g， CaCl2 10_20g，Tween80 0.15-0.25g，微量元素：FeS〇4.7H20 0.003-0.005g，MnS04.H20 0.001-0.00156g,ZnS04· 7H20 0.001-0.0014g,C0CI2 · 6H20 0.001-0.002g,pH 5.0〇
[0019] 本發(fā)明還提供了根據(jù)上述篩選方法篩選得到的菌株作為生產(chǎn)維素酶的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種維素酶的生產(chǎn)方法，所述方法包括以下步驟：
[0021] (1)使用液態(tài)種子培養(yǎng)基對根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法篩選得到的菌株TP-02 進(jìn)行種子培養(yǎng)，得
[0022]到種子培養(yǎng)液；
[0023] (2)將種子培養(yǎng)液接種到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。
[0024] 所述步驟(1)具體包括以下步驟:對根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法篩選得到的菌 株TP-02先后經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基、液態(tài)種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并將所得種子液保存在-80°C超 低溫甘油凍結(jié)管中；將在-80°C超低溫甘油凍結(jié)管中保存的種子液先后經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基、 液態(tài)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后即可制得種子培養(yǎng)液。
[0025] 所述步驟(2)中，種子培養(yǎng)液與液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的體積之比為1:9~10。
[0026] 所述步驟(2)中的培養(yǎng)條件是30°C、200~350r/min培養(yǎng)84~96小時。
[0027]進(jìn)一步地，所述步驟（2)中的培養(yǎng)條件還包括：攪拌轉(zhuǎn)速為450r/min，通氣量為 4.5vvm，罐壓為0.03MPa，pH為5 · 0~5 · 5范圍，此過程中通過流加氨水控制pH在5 ·0~5 · 5范 圍內(nèi)。
[0028] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0029] 1.菌種生長速度快，產(chǎn)酶速率高，發(fā)酵時間短，在4d內(nèi)可結(jié)束發(fā)酵；
[0030] 2.菌種為野生菌，活力旺盛，不易染菌，易于純培養(yǎng)；
[0031] 3.菌種可利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物如麩皮汁、稻草秸桿(或麥秸桿、玉米秸桿)發(fā)酵產(chǎn)纖維 素酶，營養(yǎng)基質(zhì)利用范圍廣且成分廉價、易得；
[0032] 4.重復(fù)搖瓶發(fā)酵性能穩(wěn)定，其濾紙酶活力達(dá)到13. 16IU/mL，內(nèi)切酶酶活達(dá)到 45 · 81 IU/mL，外切酶酶活達(dá)到0 · 537IU/mL，葡聚糖苷酶酶活力達(dá)到12 · 45IU/mL;
[0033] 5.在發(fā)酵罐中培養(yǎng)72小時后，其其濾紙酶活力可達(dá)到16.98IU/mL，內(nèi)切酶酶活達(dá) 到41 · 33IU/mL，外切酶酶活達(dá)到3 · 65IU/mL，葡聚糖苷酶酶活力達(dá)到15 · 98IU/mL;
[0034] 6.發(fā)酵pH適應(yīng)范圍廣，工藝控制簡單。
【附圖說明】
[0035] 圖1為初篩菌落在培養(yǎng)基上的水解圈；
[0036] 圖2為實施例5中TP-02菌株產(chǎn)酶特性研究；
[0037] 圖3為實施例6中TP-02菌株產(chǎn)酶特性研究。
【具體實施方式】
[0038] 實施例1
[0039] -種產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟：
[0040] 初篩：
[00411取1 g含有目的菌種的材料(黃山生態(tài)林腐木)粉碎;加入1 OmL生理鹽水，振蕩lh。將 上述懸浮液全部加入200mL PDA培養(yǎng)基中，30°C，180rpm振蕩培養(yǎng)12h;
[0042] 將上述培養(yǎng)物利用生理鹽水依次稀釋10倍至10'10'10-5,并分別涂布于PDA平 板培養(yǎng)基上，30°C靜置培養(yǎng)至有菌落出現(xiàn)，選取典型單菌落轉(zhuǎn)接PDA斜面，并同時制片做純 度檢查，獲得純培養(yǎng)體;將純培養(yǎng)體點種至初篩培養(yǎng)基，所述初篩培養(yǎng)基的成分為:每L培養(yǎng) 基含有:CMC-Na 5-10g;葡萄糖3-5g;瓊脂 10-20g;MandelS無機(jī)營養(yǎng)鹽 1000mL，28°C培養(yǎng)48h 后用lmg/mL的剛果紅染液染色2h，傾去染液后再用lmol/L的NaOH溶液洗滌過多染液，抑制 酶活性，固定水解圈大小。菌體若能分泌纖維素酶，則在菌落周圍會出現(xiàn)清晰的水解圈，依 據(jù)水解圈與菌落直徑比值