第二個PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的基因為模板，用引物IFNa-Fl 和IFN γ -R1擴(kuò)增出融合基因，即串聯(lián)鴨a、γ干擾素基因（鴨IFNa-linker-IFN γ基因）。 [0028] 一種表達(dá)串聯(lián)鴨€1、丫干擾素基因的原核表達(dá)質(zhì)粒邱了32&-正_-1丨111?^-正~丫，通 過BamH I和Hind III酶切位點將串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因（鴨IFNa-linker-IFN γ基因）連接 到原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a( + )上。
[0029] 上述原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的制備方法，具體步驟如下：
[0030] 1)串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因（鴨IFNa-linker-IFNy基因）克隆至PMD-19T載體：
[0031] 將PCR擴(kuò)增純化后的串聯(lián)鴨a、γ干擾素基因（鴨IFNa-linker-IFN γ基因）連接入 PMD-19T載體，16°C連接過夜后進(jìn)行轉(zhuǎn)化;挑取菌落接種于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中繼 續(xù)培養(yǎng)，用菌液PCR的方法篩選出陽性克隆，測序正確后擴(kuò)大培養(yǎng)，獲取該基因的陽性質(zhì)粒 pMD-19T-IFNa-linker-IFNy ；
[0032] 2)重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的構(gòu)建：
[0033] 用BamH I和Hind III限制性內(nèi)切酶分別對pMD-19T-IFNa-linker-IFNy 和pET32a 空載體進(jìn)行雙酶切，膠回收獲得酶切后的基因片段和載體片段，應(yīng)用T4連接酶，將目的片段 連接到pET32a( + )載體上，構(gòu)建出重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ;將上述構(gòu) 建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)后，挑取菌落接種于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中 進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用菌液PCR方法篩選出陽性克隆，獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IFNa-linker-IFN γ 〇
[0034] 上述串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的應(yīng)用，具體體現(xiàn)在上述串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因表達(dá) 的融合蛋白在制備鴨的抗病毒藥物方面的應(yīng)用。
[0035] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0036] (1)本發(fā)明成功構(gòu)建了重組鴨α、γ干擾素原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IFNa-linker-IFN γ，實現(xiàn)了鴨IFN-a和IFN- γ基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)上的串聯(lián)表達(dá)。另外，兩個基因 通過(G4S)3疏水的柔性氨基酸接頭連接，不僅可以保證兩個干擾素基因以1:1的比例進(jìn)行 表達(dá)，還可以使兩種鴨干擾素充分延展、正確折疊，以獲取最大的生物學(xué)活性。
[0037] (2)體外體內(nèi)抗病毒實驗證明，本發(fā)明所構(gòu)建的融合蛋白具有較高的抗病毒活性。 體外抗病毒實驗中，純化復(fù)性后的重組鴨IFNa-linker-IFN γ融合蛋白抗VSV、AIV和DPV活 性分別為2.61 X 107U/mg、1.12 X 107U/mg和1.07 X 107U/mg，明顯高于單個鴨干擾素的抗病 毒活性;體內(nèi)實驗表明，純化復(fù)性后的重組鴨IFNa-1 inker-IFN γ融合蛋白對AIV和DPV感染 鴨的保護(hù)率明顯提高，感染鴨的排毒量及臟器含毒量也明顯降低。因此，該發(fā)明提供了一種 成本低、活性高的重組鴨干擾素融合蛋白，可有效控制病毒性疾病的快速傳播，減少經(jīng)濟(jì)損 失。
【附圖說明】
[0038] 圖1為S0E-PCR擴(kuò)增的鴨IFNa-1 inker-1FN γ基因電泳檢測結(jié)果圖；其中，泳道Μ: DL2000marker;泳道 1: S0E-PCR擴(kuò)增鴨IFNa-1 inker-IFN γ 結(jié)果；泳道2:陰性對照。
[0039] 圖2為western blot檢測其表達(dá)的結(jié)果圖；其中，泳道Μ:低分子量蛋白marker;泳 道1: pET32a-IFNa表達(dá)產(chǎn)物；泳道2: pET32a-IFN γ 表達(dá)產(chǎn)物；泳道3: pET32a-IFNa/IFN γ 表 達(dá)產(chǎn)物。
[0040] 圖3為SDS-PAGE檢測其表達(dá)的結(jié)果圖；其中，泳道Μ:低分子量蛋白marker;泳道1: pET32a空載體表達(dá)沉淀；泳道2: pET32a空載體表達(dá)上清；泳道3: pET32a-IFNa表達(dá)沉淀；泳 道4: pET32a-IFNa表達(dá)上清；泳道5: pET32a-IFN γ表達(dá)沉淀；泳道6 : pET32a-IFN γ表達(dá)上 清;泳道7: pET32a-IFNa/IFN γ表達(dá)沉淀;泳道8: pET32a-IFNa/IFN γ表達(dá)上清。
【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0042] 實施例1串聯(lián)表達(dá)鴨α、γ干擾素基因的原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0043] 1.引物的設(shè)計與合成
[0044] 根據(jù)Genbank中提供的鴨IFN-a的基因序列（GenBank no.KJ874343)和IFN-γ的基 因序列（GenBank no · KF746069)，分別設(shè)計2對引物IFNa-Fl、IFNa-Rl和IFN γ-FI、IFN γ-R1，用于擴(kuò)增去除信號肽后的鴨IFN-a和IFN- γ基因，并分別在2對引物的上游和下游加入 BamH I和Hind ΙΠ 酶切位點。同時，設(shè)計用于S0E-PCR的引物IFNa-R2和IFN γ -F2,其中，IFN a-R2中含有部分linker序列，IFNy_F2中含有部分與IFNa-R2互補(bǔ)的linker序列。引物序列 如下：
[0045]去除信號肽后IFN-a的擴(kuò)增引物：
[0046] IFNa-Fl：CGGGATCC TTCTCCTGCAGCCCCCTGCG；
[0047] IFNa-Rl：CCCAAGCTTTTAGCGCATGGTGCGGGTGA；
[0048] IFNa-R2：
[0049] CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCGCGCATGGTGCGGGTG;去除信號肽后IFN- γ 的擴(kuò)增引物：
[0050] IFN γ-FI：CGGGATCC TCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0051] IFN γ-F2：
[0052] TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0053] IFN γ-R1:CCCAAGCTTTTAACATCTGCATCTCTTTGGA。
[0054] 2.鴨α、γ干擾素基因的擴(kuò)增
[0055] 從鴨外周血淋巴細(xì)胞中抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，得到擴(kuò)增鴨α、γ干擾素基因的cDNA 模板，以此cDNA為模板，分別用上述IFNa-Fl、IFNa-Rl和IFN γ -FI、IFN γ -R1引物，擴(kuò)增出所 需鴨α、γ干擾素目的基因，PCR反應(yīng)體系為50yL，其中Ex Taq酶lyL，4XdNTP mix 4yL， ddH20 41.5yL，上、下游引物各lyL，cDNAl. 5yL。反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性94°C4min，然后進(jìn)行35 個循環(huán)，循環(huán)反應(yīng)條件為941€3〇8、55 1€358、721€21^11，最后72°(：延伸1〇1^11。？0?產(chǎn)物進(jìn)行 1.0 %瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約492kb和435kb的擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期的結(jié)果相符。
[0056] 3.S0E-PCR擴(kuò)增鴨IFNa-linker-IFNy 基因
[0057] 該過程主要包含3個PCR反應(yīng)，第一個PCR:以IFNa-Fl和IFNa-R2為引物擴(kuò)增出含有 部分1 inker序列的IFN-a，以IFN γ -F2和IFN γ -R1為引物擴(kuò)增出含有部分1 inker序列的 IFN-γ并分別進(jìn)行膠回收(反應(yīng)體系及方法如上1.2所述）；第二個PCR:以第一個PCR擴(kuò)增出 的基因為模板，不加引物，進(jìn)行10-15個PCR反應(yīng)，其它反應(yīng)條件不變;第三個PCR反應(yīng)，以第 二個PCR產(chǎn)物為模板，用引物IFNa-Fl和IFN γ -R1擴(kuò)增出融合基因 IFNa-1 inker-IFN γ，反應(yīng) 體系及方法同上。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果如圖1所示，可見約1029kb 的擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符。
[0058] 4.鴨IFNa-linker-IFNy 基因克隆至pMD-19T Vector
[0059] 將擴(kuò)增得到的鴨IFNa-1 inker-IFN γ基因用Omega公司膠回收試劑盒進(jìn)行回收，然 后將回收的目的基因連接到PMD-19T載體上，連接反應(yīng)體系為：Ligation SolutionI5yL、 PMD-19T Vector 0.5yL、PCR純化產(chǎn)物4.5yL，16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài) 細(xì)菌，接種于氨芐青霉素抗性的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。挑選菌落于氨芐青霉素抗性的LB 培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)6h，用菌液PCR方法篩選出陽性克隆。菌液PCR反應(yīng)體系為rTaq 10yL， ddH20 8.4yL，上、下游引物各0.2yL，菌液1.2yL。反應(yīng)參數(shù)為:預(yù)變性94°C4min，然后進(jìn)行35 個循環(huán)，循環(huán)反應(yīng)條件為94 1€3〇8、551€358、721€21^11，最后72°(：延伸1〇1^11。？0?產(chǎn)物進(jìn)行 1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，選取部分陽性樣品測序鑒定，將測序結(jié)果正確的菌液擴(kuò)大培 養(yǎng)，獲取陽性質(zhì)粒pMD-19T