一種基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤生物治療技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于Fey Rma的嵌合基因及其 用途，還涉及基于Fc γ RIHa的基因工程化免疫細胞及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 單克隆抗體已經(jīng)逐漸成為癌癥治療中的支柱。單克隆抗體發(fā)揮治療作用的機制主 要是通過抗體依賴細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)殺死祀細胞。在單克隆抗體臨床應用中，經(jīng)常觀察到不理想的治療效 果。原因是患者經(jīng)過放化療之后單抗藥物ADCC作用的效應細胞耗竭，使得單抗藥物不能充 分發(fā)揮作用。
[0003] 嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor,CAR)CD19的T細胞（CART-19細胞）已 經(jīng)在CD19表達的B細胞惡性腫瘤的治療中取得了顯著成功(Kochenderfer et al. ,2010; Porter et al. ,2011)。常規(guī)的CAR分子的設(shè)計采用鼠源單抗的scFv結(jié)合0)3ζ與共刺激分子 (⑶28、4-1ΒΒ等)組成。針對不同組織的腫瘤相關(guān)抗原(ΤΑΑ)需要設(shè)計相應特異性的scFv，所 構(gòu)建的CAR分子只局限于針對于該種腫瘤，不具備通用性，限制了 CAR技術(shù)的臨床應用。
[0004] 常規(guī)嵌合抗原受體(CAR)分子的設(shè)計主要包括⑶8α前導區(qū)、由Linker序列連接VH 和VL形成的單鏈可變區(qū)（scFv)、CD8a鉸合區(qū)、CD8a跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導區(qū)。其中CD8a鉸合 區(qū)為scFv與抗原的結(jié)合提供靈活的空間，解決scFv與抗原結(jié)合空間位阻的問題。
[0005] FcyRina(CD16a)是唯一表達于NK細胞上可與IgG結(jié)合介導ADCC作用的Fc受體。Fc yRIIIa是一種跨膜糖蛋白，含有信號肽序列、細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。其中 細胞外結(jié)構(gòu)域與IgG的Fc段結(jié)合介導ADCC作用。陽性表達FcyRHIa的效應細胞是發(fā)揮單克 隆抗體ADCC作用的關(guān)鍵因素。臨床上迫切需要補充陽性表達Fc γ RIHa的效應細胞以提高單 克隆抗體藥物的臨床療效。
[0006] 因此，如何研發(fā)一種基于Fey RIHa的嵌合基因以及基因工程化免疫細胞以解決現(xiàn) 有單克隆抗體和嵌合抗原受體兩種技術(shù)所存在的問題已成為目前研究的重點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明基于Fc γ RIHa與抗體Fc段結(jié)合產(chǎn)生ADCC作用的原理，在優(yōu)化CAR分子結(jié)構(gòu) 的基礎(chǔ)上，設(shè)計了作用位點為Fey RIHa的CAR分子，其不僅可與多種不同的單克隆抗體藥物 聯(lián)合使用，用于多種腫瘤的治療，同時又能夠發(fā)揮CAR分子對腫瘤細胞的高效殺傷功能。
[0008] 本發(fā)明人為實現(xiàn)上述目的進行了反復深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過將嵌合基因中 的Fc γ RIHa細胞外結(jié)構(gòu)域直接與⑶8α跨膜區(qū)連接，不需要⑶8α鉸合區(qū)，該種Fc γ Rma-CAR 分子設(shè)計更有利于激活效應細胞，能顯著提高Fc γ RHIa-CAR分子對多種腫瘤細胞的殺傷能 力，可實現(xiàn)上述目的。
[0009] 即，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0010] 第一方面，本發(fā)明提供了一種基于Fey RIHa的嵌合基因，所述嵌合基因包括依次 串聯(lián)的Fc γ Rma信號肽、Fc γ Rma細胞外區(qū)域、CD8a跨膜區(qū)域和胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，所述 Fc γ Rma細胞外區(qū)域直接與⑶8a跨膜區(qū)域連接。
[0011] 本發(fā)明不同于常規(guī)CAR分子的設(shè)計。本發(fā)明所述嵌合基因中，F(xiàn)cyRHIa細胞外區(qū)域 直接與CD8a跨膜區(qū)域連接，其刪除了常規(guī)CAR分子中的CD8a鉸合區(qū)。該種設(shè)計不僅未出現(xiàn)由 Linker序列連接VH和VL形成的單鏈可變區(qū)（scFv)與抗原結(jié)合的空間位阻問題，而且，發(fā)明 人驚喜地發(fā)現(xiàn)，與未刪除CD8a鉸合區(qū)的結(jié)構(gòu)相比，該種Fc γ RHIa-CAR分子設(shè)計更有利于激 活效應細胞，更能顯著提高Fc γ Rma-CAR分子對腫瘤細胞的殺傷能力。
[0012] 本發(fā)明提供的基于Fey Rma的CAR分子既可以通過單克隆抗體藥物靶向性介導效 應細胞對腫瘤細胞進行識別，提高單克隆抗體藥物的臨床療效，又可以發(fā)揮CAR分子的腫瘤 細胞殺傷功能;采用該設(shè)計的CAR分子與單克隆抗體藥物聯(lián)合可通用于多種腫瘤的細胞治 療。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，所述Fey Rma信號肽具有如SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列，其編碼 基因序列如SEQ ID N0:3所示。
[0014] 本發(fā)明中采用Fey Rma信號肽作為信號肽，相比采用常規(guī)的⑶8α前導序列，其具 有的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在:Fey Rma信號肽為Fey Rma基因原有結(jié)構(gòu)的一部分，相對于⑶8α前 導序列，更有利于指引Fey Mia細胞外區(qū)域蛋白穿膜，并在后期剪切。本發(fā)明通過構(gòu)建含有 CD8a前導序列的Fc γ RIIIa-CAR(定義為CD8aleader-Fc γ RHIa-CAR)，與本發(fā)明設(shè)計的Fc γ R Dla信號肽Fc γ RHIa-CAR(定義為Fc γ Rllla signal peptide-Fc γ RHIa-CAR)針對腫瘤細胞 殺傷能力試驗相比較，本發(fā)明Fey Rma信號肽的選擇明顯優(yōu)于常規(guī)CAR分子設(shè)計的CD8a前 導序列。
[0015]根據(jù)本發(fā)明，所述Fey Rma細胞外區(qū)域具有如SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列，其 編碼基因序列如SEQ ID N0:4所示。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，所述⑶8α跨膜區(qū)域具有如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，其編碼 基因序列如SEQ ID N0:5所示。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合基因還含有Kozak序列；所述Kozak序列如SEQ ID NO: 2所 不。
[0018] 本發(fā)明中在信號肽區(qū)域之前采用加入Kozak序列，其具有的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在:加入 Kozak序列可用于增強本發(fā)明設(shè)計的CAR分子在真核細胞(如人T細胞和NK細胞）中的翻譯效 率。
[0019] 本發(fā)明中所述Kozak序列與Fc γ Rma信號肽和細胞外區(qū)域依次拼接，組成與單克 隆抗體Fc段結(jié)合的功能區(qū)域序列。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，所述胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域由共刺激分子和細胞活化信號拼接而成。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，所述共刺激分子為CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、ro-l、IC0S、 LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或CD83中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為CD28 或4-1BB中的任意一種或兩種的組合，進一步優(yōu)選為4-1BB。
[0022]本發(fā)明中采用4-1BB作為優(yōu)選的共刺激分子，其具有的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在:4-1ΒΒ作 為共刺激分子相對于CD28更有利于T細胞在體內(nèi)的存活。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，所述4-1BB具有如SEQ ID N0:11所示的氨基酸序列，其編碼基因序列 如SEQ ID N0:6所示。
[0024]根據(jù)本發(fā)明，所述細胞活化信號為CD3G信號傳導結(jié)構(gòu)域。
[0025]根據(jù)本發(fā)明，所述⑶3ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域具有如SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列， 其編碼基因序列如SEQ ID N0:7所示。
[0026]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述嵌合基因由Kozak序列、Fey Rma信號肽、Fey Rma細胞外 區(qū)域、CD8a跨膜區(qū)域、共刺激分子和CD3G信號傳導結(jié)構(gòu)域依次串聯(lián)拼接而成，所述Fey Rma 細胞外區(qū)域直接與CD8a跨膜區(qū)域連接，不含有CD8a鉸合區(qū)。
[0027] 本發(fā)明中的無⑶8a鉸合區(qū)的Fc γ Rma-CAR分子結(jié)構(gòu)具體為：
[0028] Kozak-Fc γ Rllla信號肽（signal peptide)_Fc γ Rllla細胞外區(qū)域（extracellular port ion) _CD8a 跨膜區(qū)域（transmembrane region )-4-lBB_CD3G。
[0029] 本發(fā)明優(yōu)選采用上述串聯(lián)拼接結(jié)構(gòu)，作為一個整體，其具有的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在： Kozak序列可以增強在真核細胞中的翻譯效率;Fey Rma信號肽更有利于指引Fey Rma細 胞外區(qū)域蛋白穿膜，并在后期剪切;Fc γ Rllla的細胞外區(qū)域直接與CD8a跨膜區(qū)相連，更有利 于激活該CAR分子修飾的T細胞;4-1BB作為共刺激分子更有利于T細胞在體內(nèi)的存活。本發(fā) 明所設(shè)計的上述串聯(lián)拼接結(jié)構(gòu)構(gòu)成的CAR分子，可以靶向性高效的殺傷腫瘤細胞。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合基因優(yōu)選具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0031] 以上各分子的核苷酸序列和氨基酸序列可利用分子生物學領(lǐng)域已知的基因重組 方法獲得，例如以表達基因的細胞的eDNA為文庫，通過PCR擴增的方式得到該基因，優(yōu)選核 酸序列被合成生產(chǎn)，而不是克隆。