一種對(duì)生產(chǎn)二十二碳六烯酸隱甲藻進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)生產(chǎn)二十二碳六烯酸隱甲藻進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]二十二碳六稀酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)是人腦發(fā)育、成長(zhǎng)的重要物質(zhì)之一，是大腦和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，在人體大腦皮層中含量高達(dá)20%，在眼睛視網(wǎng)膜中所占比例最大，約占50%。因此，它對(duì)胎兒和嬰幼兒的大腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育，以及成年人腦功能的維修等方面有著重要的作用。此外，DHA對(duì)冠心病、中風(fēng)、高血壓等心血管系統(tǒng)的疾病、神經(jīng)失常、老年癡呆癥和抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)的疾病也有積極的影響。DHA作為一種必需脂肪酸，其增強(qiáng)記憶與思維能力、提高智力等作用更為顯著。人群流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)DHA含量高的人的心理承受力較強(qiáng)，智力發(fā)育指數(shù)也高。DHA還可用于癌癥治療，抑制發(fā)炎等。據(jù)荷蘭帝斯曼公司的估計(jì)，DHA的全球市場(chǎng)價(jià)值約為25-26.2億美元，并且以每年15%以上的速度增長(zhǎng)。
[0003]截止目前為止，深海魚油一直是市售的DHA的主要來(lái)源。但這一主要來(lái)源存在諸多缺點(diǎn)，比如海洋污染造成的對(duì)魚油安全性的擔(dān)憂，魚油質(zhì)量會(huì)隨著魚的種類、捕撈季節(jié)和地點(diǎn)的不同而不同，含EPA、易受環(huán)境污染、純化成本高，魚油的特殊氣味也限制了魚油來(lái)源的DHA作為一種食品添加劑的應(yīng)用。尤其是考慮到DHA的主要消費(fèi)者是懷孕婦女和年幼的孩子，其可能的不利影響更令人擔(dān)憂；此外，世界漁業(yè)資源的逐年萎縮對(duì)DHA的可持續(xù)性供應(yīng)的影響也值得考慮。
[0004]利用隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)發(fā)酵生產(chǎn)DHA，與傳統(tǒng)魚油來(lái)源相比，具有一系列優(yōu)點(diǎn)，如發(fā)酵周期短，培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單，微生物生長(zhǎng)快，易于大規(guī)模培養(yǎng)；多不飽和脂肪酸含量高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，氧化穩(wěn)定性較好，不飽和脂肪酸成分單一，不含EPA或EPA含量低，易于分離純化；同時(shí)克服了傳統(tǒng)的從魚油中獲取DHA受原料、氣候、產(chǎn)地、生產(chǎn)周期等諸多限制因素的影響。因此微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA可替代魚油來(lái)源的DHA，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0005]鑒于隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA的優(yōu)勢(shì)，有必要發(fā)展相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其體內(nèi)積累油脂的代謝途徑及其調(diào)控進(jìn)行深入的研究，同時(shí)發(fā)展相關(guān)的基因工程改造策略以進(jìn)一步提高隱甲藻合成DHA的產(chǎn)率。然而，目前針對(duì)隱甲藻尚缺乏有效的基因轉(zhuǎn)化手段，使得相關(guān)的研究和提高產(chǎn)率的工作無(wú)法進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種針對(duì)隱甲藻敏感的抗生素，以及提供一種對(duì)隱甲藻進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
(O隱甲藻敏感抗生素潮霉素B作用濃度的確定: ①培養(yǎng)基的配制:
在C9N2培養(yǎng)基(葡萄糖9 g，酵母浸粉2 g，海鹽25 g，加水至I L)中對(duì)潮霉素B設(shè)置濃度梯度，10 mg/L- 50 mg/L ；
②潮霉素B敏感濃度的確定:
隱甲藻在25°C，180 rpm條件下振蕩培養(yǎng)48 h，取50 μ I細(xì)胞懸浮液均勻涂布在5個(gè)梯度平板上，25°C倒置培養(yǎng)2周(無(wú)抗平板培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照)，最終確定隱甲藻對(duì)潮霉素B的敏感濃度為40 mg/L ;
(2)基因轉(zhuǎn)化體系的建立:
①隱甲藻感受態(tài)細(xì)胞的制備:
取隱甲藻懸浮培養(yǎng)48h的細(xì)胞10 mL, 4°C, 3500 rpm離心5 min，棄上清，加入I mL 25mM DTT溶液，30°C水浴15 min，離心5 min，棄上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗細(xì)胞三次，I mL山梨糖醇重懸細(xì)胞備用；
②焚光標(biāo)記大分子FITC-Dextran(70 kDa)的轉(zhuǎn)化:
FITC-Dextran (70 kDa)是一種熒光標(biāo)記的大分子物質(zhì)，在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部之后能夠自發(fā)綠色熒光使細(xì)胞帶有綠色熒光標(biāo)記。因此，為了驗(yàn)證隱甲藻感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率和確定最佳的電擊條件，選擇焚光標(biāo)記的大分子聚合物FITC-Dextran (70 kDa)作為轉(zhuǎn)化的分子。在無(wú)菌條件下取200 μ I隱甲藻感受態(tài)細(xì)胞至于2 μπ?電極杯中，加入I μ I鮭魚精DNA和2 μ g FITC-Dextran混勾，冰浴5 min，其中不加入FITC-Dextran的作為陰性對(duì)照，加入FITC-Dextran但不電擊的作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)置電壓1.4 kV，1.6 kV，1.8 kV，2.0 kV，
2.2 kV和2.4 kV，電阻200 Ω，電容25和50 μ F進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電擊結(jié)束之后在冰上冰浴5 min，用2 mL C9N2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并加入胰蛋白酶37°C培養(yǎng)30 min，熒光顯微鏡鏡檢細(xì)胞，觀察是否有發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，熒光分光光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)化之后細(xì)胞懸浮液的熒光值。通過(guò)比較細(xì)胞懸浮液之間熒光值的差異最終確定電擊轉(zhuǎn)化條件為電壓2.0 kV，電阻200 Ω，電容25 μ F ；
(3)外源基因片段的準(zhǔn)備:
①隱甲藻18S基因上游片段的擴(kuò)增:
取隱甲藻基因組溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP 0.4 μ I,10 μΜ上游引物I μ1、10 μΜ下游引物I μ?，Phus1n酶0.2 μ?，無(wú)菌水12.4 μ I,在PCR管中混勻；將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增程序?yàn)?98°C 30 s ;98°C 10s，55°C 30 s’72V 30 s，共30個(gè)循環(huán)，4°C 5 min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻18S的上游片段；
②隱甲藻18S基因下游片段的擴(kuò)增:
取隱甲藻基因組溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP 0.4 μ I,10 μΜ 上游引物 I μ1、10 μΜ 下游 I μ I，Phus1n 酶 0.2 μ?，無(wú)菌水 12.4 μ?，在 PCR管中混勻；將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增程序?yàn)?98°C 30 s ；98°C 10 s，55°C30 s，72°C 30 s，共30個(gè)循環(huán)，4°C 5 min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻18S的下游片段；
③潮霉素抗性基因(如?)的擴(kuò)增
取 PCAMBIA1301 植物表達(dá)載體溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的dNTP 0.4 μ 1,10 μΜ 上游引物 I μ1、10 μΜ 下游 I μ 1，Phus1n酶0.2 μ?，無(wú)菌水 12.4μ 1，在PCR管中混勻；將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增程序?yàn)?98°C 30 s ；98°C10 s，55°C 30 s’72V 40 s，共30個(gè)循環(huán)，4°C 5 min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得潮霉素抗性基因片段；
④用于同源雙交換整合的基因片段的構(gòu)建:
取擴(kuò)增后的隱甲藻18s上游片段、18s下游片段、以及Hpt片段各10 ng為模板，5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP0.4 μ 1，Phus1n 酶 0.2 μ 1，無(wú)菌水 10.4μ?，以10 μΜ上游引物I μ1、10 μΜ下游引物I μ 1，在PCR管中混勾，將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增程序?yàn)?98°C 30 s ；98°C 10 s，60°C 90 s，72°C 30 s，共30個(gè)循環(huán)，4°C 5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得目的片段(上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段融合PCR產(chǎn)物)；
(4)外源目的基因片段對(duì)隱甲藻的轉(zhuǎn)化；
①隱甲藻感受態(tài)細(xì)胞的制備:
取隱甲藻懸浮培養(yǎng)48 h的細(xì)胞10 mL, 4°C, 3500 rpm離心5 min，棄上清，加入I mL25 mM DTT溶液，30°C水浴15 min，離心5 min，棄上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗細(xì)胞三次，I mL山梨糖醇重懸細(xì)胞備用；
2外源目的基因片段的轉(zhuǎn)化:
在無(wú)菌條件下取200 μ I隱甲藻感受態(tài)細(xì)胞至于2 μπ?電極杯中，加入I μ I鮭魚精DNA和2 μ g目的片段混勻，冰浴5 min,電擊轉(zhuǎn)化條件為2.0 kV，電阻200 Ω，電容25μ F，電擊之后冰浴5 min,加入2 mL新鮮C9N2培養(yǎng)基25°C，180 rpm震蕩復(fù)蘇48 h，取50μ I細(xì)胞懸浮液均勻圖涂布在含有40 mg/L潮霉素B的C9N2固體平板上，倒置培養(yǎng)2周，將平板上長(zhǎng)出的單克隆細(xì)胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上劃線，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的復(fù)篩，待長(zhǎng)出單克隆細(xì)胞，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)。通過(guò)基因組PCR對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步驗(yàn)證。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過(guò)抗生素耐性實(shí)驗(yàn)，鑒定出一種隱甲藻敏感的抗生素潮霉素B，采用潮霉素B作為篩選標(biāo)記建立了有效的隱甲藻轉(zhuǎn)化體系，這對(duì)開展針對(duì)隱甲藻的基因工程改造，進(jìn)而提高DHA產(chǎn)率有著現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用價(jià)值。
[0009]
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為隱甲藻在不同潮霉素濃度下的生長(zhǎng)。
[0011]圖2為電擊轉(zhuǎn)化FITC-Dextran熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的圖。(左邊為明視野下的隱甲藻細(xì)胞，右邊為該細(xì)胞在暗視野下發(fā)熒光)。
[0012]圖3為抗潮霉素B的突變株和野生株在潮霉素B抗性平板上生長(zhǎng)狀況的對(duì)照?qǐng)D(其中，5#是第一輪初篩得到的轉(zhuǎn)化子，WT為野生型隱)。
[0013]圖4為轉(zhuǎn)化后的突變株的PCR鑒定圖(其中，M是DNA Maeker III ;分別用野生型(1、
2泳道)和5#突變株(3、4泳道)的基因組模板做PCR ；18s用作PCR陽(yáng)性對(duì)照)。
[0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面的實(shí)施例是為了本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明但不用于限制本發(fā)明。
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0017]實(shí)施例1
一種對(duì)隱甲藻ATCC 30556進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法，包括下述步驟:
(O隱甲藻ATCC 30556敏感抗生素潮霉素B作用濃度的確定:
隱甲藻ATCC 30556敏感抗生素潮霉素B作用濃度的確定是通過(guò)抗生素濃度梯度實(shí)現(xiàn)的；
步驟為:在C9N2培養(yǎng)基中對(duì)潮霉素B設(shè)置濃度梯度，10 mg/L- 50 mg/L。隱甲藻在25°C, 180 rpm條件下振蕩培養(yǎng)48 h，取50 μ I細(xì)胞懸浮液均勻涂布在5個(gè)梯度平板上，25°C倒置培養(yǎng)2周(無(wú)抗平板培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照)；最終確定隱甲藻ATCC 30556對(duì)潮霉素B敏感濃度為40 mg/L ο
[0018](2)隱甲藻ATCC 30556感受態(tài)細(xì)胞的制備及熒光標(biāo)記大分子FITC-Dextran (70kDa)的轉(zhuǎn)化:
隱甲藻ATCC 30556感受態(tài)細(xì)胞的制備是通過(guò)DTT溶液預(yù)處理細(xì)胞，使細(xì)胞的細(xì)胞壁變薄，通過(guò)高滲透壓的山梨糖醇溶液的反復(fù)洗滌去掉細(xì)胞懸浮液中混有的其他離子，保證電擊的效率；
步驟為:取隱甲藻ATCC 30556懸浮培養(yǎng)48 h的細(xì)胞10 mL, 4°C, 3500 rpm離心5 min,棄上清，加入I mL 25 mM DTT溶液，30°C水浴15 min，離心5 min，棄上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗細(xì)胞三次，I mL山梨糖醇重懸細(xì)胞備用；
在無(wú)菌條件下取200 μ I隱甲藻ATCC 30556感受態(tài)細(xì)胞至于2 μπ?電極杯中，加入Iμ I娃魚精DNA和2 μ g FITC-Dextran混勾，冰浴5 min，其中不加入FITC-Dextran的作為陰性對(duì)照，加入FITC-Dextran但不電擊的作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)置電壓1.4 kV，電阻200 Ω，電容25 μ F進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電擊結(jié)束之后在冰上冰浴5 min，用2 mL C9N2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并加入胰蛋白酶37°C培養(yǎng)30 min，熒光顯微鏡鏡檢細(xì)胞，觀察是否有發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，熒光分光光度計(jì)測(cè)定