一種重組pcgur慢病毒干擾載體、慢病毒、構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組PCGUR慢病毒干擾載體、慢病毒，本 發(fā)明還涉及一種重組PCGUR慢病毒干擾載體、慢病毒的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢病毒(Lentivirus)是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能 力，慢病毒目前可以在細(xì)胞或者體內(nèi)實現(xiàn)長效的外源基因表達和基因沉默。
[0003] 微小RNA(microRNA，miRNA)是目前研究最多的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度 約為19 - 2 3n t，m i RNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制 或降解，抑制蛋白質(zhì)的合成，產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)。作為miRNA中的一員，mmu-miR-199b-5p是 2003年由Lagos-Quintana首先從鼠細(xì)胞克隆得到，隨著對其研究的不斷深入，mmu-miR-199b-5P基因在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜異位癥等多種疾病中都有異常的表達。mmu-miR-199b-5p通過影響細(xì)胞增殖、調(diào)亡、侵襲和血管形成，參與腫瘤形成發(fā)展的各個階段。目 前，miRNA在婦科常見疾病如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌以及子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮作用的具體調(diào) 控機制還不是十分清楚，但已有證據(jù)表明miRNA參與調(diào)控其發(fā)生發(fā)展。隨著miRNA的深入研 究，有望可能作為一種新的腫瘤生物學(xué)標(biāo)記物，對其在癌前病變以及惡性腫瘤中的特異表 達進行檢測，有助于對婦科惡性腫瘤的早期診斷，尤其有助于對那些早期無明顯臨床癥狀 的腫瘤患者進行篩選。
[0004] 然而現(xiàn)有技術(shù)的缺點是，缺乏一種干擾mmu-miR-199b-5p基因表達的慢病毒干擾 載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種重組PC⑶R慢病毒干擾載體、慢病毒、構(gòu)建方法及應(yīng)用， 解決了現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種干擾mmu-miR-199b-5p基因表達的慢病毒干擾載體的問題。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種重組PCGUR慢病毒干擾載體，將購買的慢病毒干 擾載體PCGUR，經(jīng)內(nèi)切酶Agel和內(nèi)切酶EcoRI雙酶切后，得到一個長序列片段和一個短序列 片段，然后在所述長序列片段內(nèi)，連入改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段，得到重組 PCGUR慢病毒干擾載體，所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈的核苷酸序列 如SEQ ID N0.3所示，反義鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種重組PCGUR慢病毒干擾載體的構(gòu)建方法，具體按 照以下步驟實施：
[0008] 步驟1，獲得改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段
[0009] 步驟1.1，化學(xué)合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈，其核苷酸序 列如SEQ ID N0.3所示；
[0010] 化學(xué)合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的反義鏈，其核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示；
[0011] 步驟1.2,將步驟1.1中獲得的正義鏈配置成正義鏈溶液，將步驟1.1中獲得的反義 鏈配置成反義鏈溶液，經(jīng)退火反應(yīng)，獲得改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段；
[0012] 步驟2，獲得重組PCGUR慢病毒干擾載體
[0013] 步驟2.1，購買慢病毒干擾載體PCGUR，并利用內(nèi)切酶Agel和內(nèi)切酶EcoRI對慢病毒 干擾載體PCGUR進行雙酶切，得到一個長序列片段和一個短序列片段，然后將長序列片段進 行回收，獲得慢病毒干擾載體PCGUR的長序列片段產(chǎn)物；
[0014] 步驟2.2，將步驟1.2中獲得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段和步驟2.1中 獲得的慢病毒干擾載體PCGUR的長序列片段產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶連接，獲得連接產(chǎn)物，然后 將所述連接產(chǎn)物回收，獲得重組PCGUR慢病毒干擾載體。
[00?5] 優(yōu)選的，所述步驟1中，獲得改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段，具體按照一下 步驟實施：
[0016]步驟1. la，化學(xué)合成mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，并在其5'端添加核苷酸序列ccgg，在3'端添加核苷酸序列ttttttg，形成 改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈；
[0017] 化學(xué)合成mmu-miR-199b-5p基因特異片段的反義鏈，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示，并在其5'端添加核苷酸序列aattcaaaaaa，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片 段的反義鏈。
[0018] 優(yōu)選的，所述退火反應(yīng)的反應(yīng)體系為：正義鏈溶液17-18yL，反義鏈溶液17-18yL， 10倍濃縮的退火緩沖液4-6yL，總體積40yL，將該退火體系混勻后置于95°C水浴10-20min， 之后自然冷卻至室溫；
[0019]所述雙酶切的酶切反應(yīng)體系包括：l-2yL的慢病毒干擾載體PCGUR，10倍濃縮的內(nèi) 切酶緩沖液5-6yL，l-2yL的內(nèi)切酶Agel，l-2yL的內(nèi)切酶EcoRI，38-42yL的雙蒸水，總體積50 yL，反應(yīng)溫度37 °C，反應(yīng)時間2h，其中，慢病毒干擾載體PCGUR的濃度為0.5-1.5yg/yL，內(nèi)切 酶Agel的濃度為8-12U/yL，內(nèi)切酶EcoRI的濃度為8-12U/yL;
[0020] 所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段和步驟2.1中獲得的慢病毒干擾載體 PCGUR的長序列片段產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶連接的連接反應(yīng)體系為:改造的mmu-miR-199b-5p 基因特異片段4-5yL，慢病毒干擾載體PCGUR的長序列片段產(chǎn)物4-5yL，10倍濃縮的T4DNA連 接酶緩沖液2-3yL，l-2yL的T4DNA連接酶，5-9yL的雙蒸水，總體積為20yL，反應(yīng)溫度22°C，反 應(yīng)時間lh，其中，改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的濃度為90-1 lOng/yL，慢病毒干擾 載體PCGUR的長序列片段產(chǎn)物的濃度為30-50ngAiL，T4DNA連接酶的濃度為380-420UAiL。
[0021] 優(yōu)選的，所述退火反應(yīng)的反應(yīng)體系為：正義鏈溶液18yL，反義鏈溶液18yL，10倍濃 縮的退火緩沖液4-6yL，總體積40yL，將該退火體系混勻后置于95 °C水浴10min，之后自然冷 卻至室溫；
[0022] 雙酶切的酶切反應(yīng)體系中，所述雙酶切的酶切反應(yīng)體系包括:2yL的慢病毒干擾載 體PCGUR，10被濃縮的內(nèi)切酶緩沖液5yL，lyL的內(nèi)切酶Agel，lyL的內(nèi)切酶EcoRI，41yL的雙蒸 水，總體積50yL，反應(yīng)溫度37 °C，反應(yīng)時間2h，其中，慢病毒干擾載體PCGUR的濃度為1μg/μL， 內(nèi)切酶Agel的濃度為lOU/yL，內(nèi)切酶EcoRI的濃度為lOU/yL;
[0023] 所述經(jīng)T4DNA連接酶連接的連接反應(yīng)體系為:改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片 段5此，慢病毒干擾載體PCGUR的的長序列片段產(chǎn)物5yL，10倍濃縮的T4DNA連接酶緩沖液2μ L，lyL的T4DNA連接酶，7yL的雙蒸水，總體積為20yL，反應(yīng)溫度22 °C，反應(yīng)時間lh，其中，改造 的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的濃度為1 OOng/yL，慢病毒干擾載體PCGUR的長序列片段 產(chǎn)物的濃度為40ng/yL，T4DNA連接酶的濃度為400U/yL。
[0024] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種慢病毒，該慢病毒利用重組PCGUR慢病毒干擾載 體為材料構(gòu)建而成。
[0025] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種慢病毒的構(gòu)建方法，以輔助質(zhì)粒psPAX2、輔助質(zhì) 粒pMD2. G和含有mmu-miR-199b-5p基因特異片段的重組PCGUR慢病毒干擾載體為材料，在細(xì) 胞中包裝成慢病毒。
[0026]優(yōu)選的，所述慢病毒的包裝具體按照以下步驟實施：
[0027] 步驟（1)，于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)293T細(xì)胞，使用的培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 溫度為37 °C，直至獲得細(xì)胞匯合度為60 %的293T細(xì)胞；
[0028]步驟(2 )，將細(xì)胞匯合度為60 %的293T細(xì)胞，進行重組PCGUR慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染， 然后于37°C培養(yǎng)16h，然后將培養(yǎng)基更換為新的DMEM完全培養(yǎng)基，并繼續(xù)于37°C培養(yǎng)48h，完 成慢病毒的包裝，獲得含有慢病毒的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液；
[0029]步驟(3)，從從步驟(2)的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中收集經(jīng)重組PC⑶R慢病毒干擾載 體包裝成的慢病毒。
[0030] 優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)染的體系為:31.56mL的滅菌水、4.44mL的濃度為2M的CaCl2、252yg 的重組PCGUR慢病毒干擾載體、168yg的質(zhì)粒、psPAX284yg的質(zhì)粒pMD2. G、2倍濃縮的HEPES-緩沖鹽溶液36mL;
[0031] 所述DMEM完全培養(yǎng)基的成分為:體積分?jǐn)?shù)為88 %的DMEM生長培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)為 10%的FBS，體積分?jǐn)?shù)為1 %的GlutaMAX溶液，體積分?jǐn)?shù)為1 %的青霉素-鏈霉素溶液。
[0032]本發(fā)明的第五個目的是提供一種重組PCGUR慢病毒干擾載體在診斷子宮內(nèi)膜癌、 卵巢癌中的應(yīng)用。
[0033]本發(fā)明的有益效果是，提供了一種重組PCGUR慢病毒干擾載體及其慢病毒，解決了 傳統(tǒng)的慢病毒，存在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低、慢病毒滴度不高的問題。
【附圖說明】
[0034]圖1是本發(fā)明重組PCGUR慢病毒干擾載體及其慢病毒的構(gòu)建流程示意圖；
[0035] 圖2是本發(fā)明使用的慢病毒干擾載體PCGUR的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0036] 圖3是本發(fā)明重組PCGUR慢病毒干擾載體的構(gòu)建方法中菌落PCR鑒定的瓊脂糖凝膠 電泳圖；
[0037] 圖4是本發(fā)明重組PC⑶R慢病毒干擾載體的構(gòu)建方法中菌落PCR鑒定的PCR膠回收 產(chǎn)物與mmu-miR-199b-5p基因特異片段的序列對比圖。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
[0039] 本發(fā)明提供一種重組PCGUR慢病毒干擾載體，以慢病毒干擾載體PCGUR和mmu-miR- 199b-5p基因特異片段為材料制備，所述mmu-miR-199b