應(yīng)用Sso7d-IN融合蛋白進(jìn)行HIV-1整合酶3′加工抑制劑篩選的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是將一種新構(gòu)建的HIV-ι整合酶應(yīng)用于3'加 工抑制劑體外篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Sso7d有助于穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)并促使DNA構(gòu)型轉(zhuǎn)變，Sso7d與IN基因連接，構(gòu)建 出的Ss〇7d-IN有較好的溶解性和活性。與野生型整合酶不同的是，它可以更有效的催化整 合體的形成以及與寡核苷酸DNA底物的相關(guān)整合過程，并將其應(yīng)用于對(duì)整合酶3'加工抑制 劑的體外篩選。
[0003]目前應(yīng)用于整合酶3'加工抑制劑常用篩選的方法有：
[0004] 1.分子信標(biāo)方法
[0005] 此方法是根據(jù)焚光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer， FRET)設(shè)計(jì)出的一段具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸鏈，兩端分別偶聯(lián)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。He根 據(jù)此原理，設(shè)計(jì)了 38nt的單鏈DNA底物，退火形成與HIV-1LTR U5相同的序列，在該鏈的5'端 和3'端分別用熒光基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)DABCYL修飾標(biāo)記。無 IN蛋白存在時(shí)，F(xiàn)AM和DABCYL空 間距離近時(shí)，F(xiàn)AM受激發(fā)后發(fā)射的熒光被DABCYL吸收淬滅，檢測(cè)不到熒光信號(hào);加入IN后，整 合酶特異性識(shí)別3'末端的CAGT序列，切下連有DABCYL的GT二核苷酸，F(xiàn)AM與DABCYL的距離變 大，F(xiàn)AM受激發(fā)后發(fā)射的熒光不再受DABCYL淬滅，激發(fā)發(fā)射能檢測(cè)到熒光信號(hào)。如抑制劑的 抑制效果好，熒光強(qiáng)度降低。本發(fā)明在此方法基礎(chǔ)上，進(jìn)行改進(jìn)，不同的是應(yīng)用Ss 〇7d-IN代 替IN，提高反應(yīng)過程中陽性與陰性值間的差異，有利于抑制劑的篩選。（何紅秋.HIV-1整合 酶活性檢測(cè)方法建立和應(yīng)用研究.北京工業(yè)大學(xué)博士論文.2010)。
[0006] 2.酶聯(lián)免疫吸附法
[0007] 此方法利用時(shí)間分辨焚光(time resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)分析法篩 選，該方法的原理是:在合成的一段HIV-1LTR U5端DNA 3'端標(biāo)記生物素，將其包被在微孔 板中，加入抑制劑孵育后加入整合酶，將生物素標(biāo)記的核苷酸被洗掉，加入親和素偶聯(lián)的Eu (SA-Eu)，SA-Eu與未剪切的生物素標(biāo)記的底物序列結(jié)合，用時(shí)間分辨熒光計(jì)可檢測(cè)熒光信 號(hào)。加入抑制劑后，熒光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)。（張旋，楊柳萌，鄭永唐.HIV-1整合酶抑制劑體外篩選 方法研究進(jìn)展，中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28 (1): 14-17)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是利用一種溶解性和活性更好的整合酶用于3'加工抑制劑的體外 篩選，提高了3'加工反應(yīng)的活性。
[0009] 本發(fā)明提供的一種應(yīng)用Ss〇7d-IN融合蛋白進(jìn)行HIV-ι整合酶3'加工抑制劑篩選的 方法，包括以下步驟：
[0010] (1 )HIV-1 Ss〇7d-IN整合酶重組蛋白及待測(cè)化合物樣品的制備
[0011]將合成的Ss〇7d基因片段與野生型整合酶（integraSe，IN)基因分別擴(kuò)增，通過融 合PCR連接，構(gòu)建Sso7d-IN表達(dá)載體，表達(dá)并純化HIV-1 Sso7d-IN整合酶重組蛋白，分裝保存 待用；室溫下將待測(cè)化合物樣品用二甲基亞砜(DMS0)配制成不同濃度的溶液，充分振蕩溶 解后備用；
[0012] (2)DNA底物的制備
[0013]用退火緩沖液溶解DNA底物后，PCR儀設(shè)定程序94°C2min，每90s下降1°C，約2h后， 底物會(huì)自發(fā)形成互補(bǔ)雙鏈。上述退火緩沖液含有10mM Tris，50mM NaCl，lmM EDTA，pH = 8.0；
[0014] DNA S^CDABCYL)；
[0015] (3)待測(cè)化合物樣品的篩選
[0016] 反應(yīng)在96孔不透明微孔板中進(jìn)行，陽性對(duì)照組2孔，每孔分別加2yL DMS0,陰性對(duì) 照組2孔，每孔分別加2yL DMS0,其他實(shí)驗(yàn)組各孔加入2yL不同濃度的待測(cè)化合物樣品；除陰 性對(duì)照組，其余都加 Sso7d-IN;具體操作如下:a、反應(yīng)體系總體積為100yL，用ddH20洗板一 次，然后每孔加入2X反應(yīng)緩沖液50yL，加入DTT 2yL，2.5yg純化的HIV-lSso7d-IN整合酶重 組蛋白；b、然后陽性對(duì)照組的孔和陰性對(duì)照組的孔分別2yL DMS0,實(shí)驗(yàn)組的其他孔加入2yL 用DMS0稀釋的待測(cè)化合物;然后ddH20補(bǔ)足體積;c、與HIV-lSs〇7d-IN整合酶重組蛋白在無 MnCl2的反應(yīng)緩沖液中37°C孵育30min后，每孔加入終濃度為10mmol/L的Mn2+、20pmol DNA底 物，混勻；37°C反應(yīng)2h，用酶標(biāo)儀讀取熒光讀值;d、同樣設(shè)置了待測(cè)化合物與DNA底物組，只 加2X反應(yīng)緩沖液50yL、20pmol DNA底物、2yL用DMS0稀釋的待測(cè)化合物，37°C孵育2h后用酶 標(biāo)儀讀取熒光讀值;選擇激發(fā)光波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為528nm;上述2X反應(yīng)緩沖液含 有40mM HEPES、200mMNaCl、50 % (g/L)甘油，pH=7 · 6;
[0017] (4)按照以下公式計(jì)算待測(cè)樣品的抑制率：
[0018]
[0019]通過測(cè)定不同濃度下的待測(cè)化合物樣品抑制率可得出待測(cè)化合物的IC50值；
[0020]由于有些待測(cè)化合物樣品對(duì)DNA熒光基團(tuán)的RFU值有直接影響，會(huì)導(dǎo)致高濃度時(shí)待 測(cè)化合物RFU〈陰性對(duì)照RFU的情況，因此需要對(duì)待測(cè)化合物RFU進(jìn)行修正，用修正后待測(cè)化 合物RFU帶入上面的公式進(jìn)行計(jì)算;在上述步驟d中設(shè)置待測(cè)化合物樣品與DNA底物組，測(cè)定 化合物不同濃度下，DNA底物RFU值的變化即下述公式中的待測(cè)化合物樣品與DNA底物組 RFU;修正后待測(cè)化合物RFU =待測(cè)化合物RFU+(陰性對(duì)照RFU-待測(cè)化合物樣品與DNA底物 組RFU)，其中待測(cè)化合物RFU指的是步驟c中其他孔的實(shí)驗(yàn)組的待測(cè)化合物RFU。
[0021] 其中HIV-lSso7d-IN整合酶重組蛋白的制備方法進(jìn)一步如下：
[0022] (1)將合成的Ss〇7d片段與IN基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到所需質(zhì)粒，以Pet_15b載體為基 礎(chǔ)構(gòu)建出Ss〇7d-IN表達(dá)載體。轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌接種于5mL含 有100mg/mL氨芐的LB液體培養(yǎng)基，37 °C搖床振蕩培養(yǎng)12-14h得到培養(yǎng)物。
[0023] (2)將（1)中的培養(yǎng)物按體積比1 %接種于LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床振蕩培養(yǎng)2-3h至 菌液0D值達(dá)到0.6-0.8，加入過濾滅菌的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)至終濃度為 0.2mM，37 °C搖床振蕩培養(yǎng)4-5h得到培養(yǎng)物。
[0024] (3)將（2)中得到的培養(yǎng)物離心得到沉淀，每lg沉淀用lOmL裂解緩沖液重懸，加 lmg/mL溶菌酶，4 °C孵育30min，置于冰浴超聲破碎lOmin，4 °C離心收集上清液。上述裂解緩 沖液含有20mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1M NaCl，5mM咪唑，10%(g/L)甘油，pH=7.5。
[0025] (4)將（3)中達(dá)到的上清液進(jìn)行鎳瓊脂糖凝膠親和層析，依次用含有20mM、40mM、 400mM咪唑的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，將收集到的含有目的蛋白的洗脫液用飽和硫酸銨溶液 沉淀蛋白，棄去上清，沉淀用保存液溶解后，分裝保存，得到純化的HIV-lSs 〇7d-IN整合酶重 組蛋白保存液體;上述保存緩沖液含有10%(g/L)甘油，0.1M NaCl，20mM Tris，lmM EDTA， ImM DTT，pH=7.6。
[0026] 合成的Ss〇7d的基因片段如下，其中有11個(gè)甘氨酸作為linker與后面的一段IN基 因相連，便于與IN融合表達(dá)，構(gòu)建質(zhì)粒；
[0027]
[0028]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0029]與之前表達(dá)的野生型整合酶相比較，在IN基因片段前連接Ss〇7d片段，構(gòu)建出 Ss〇7d-IN有較好的溶解性和活性，純化過程中無需使用高鹽及pH值較高的緩沖液，可以更 有效的催化整合體的形成以及與寡核苷酸DNA底物的相關(guān)整合過程，反應(yīng)過程設(shè)置了不加 化合物的陽性對(duì)照，從圖中可以看到Ss 〇7d-IN的活性相較于IN有顯著提高，3'加工反應(yīng)陽 性值提高了5倍左右，可以用來對(duì)HIV-1整合酶3'加工抑制劑的體外篩選。
【附圖說明】
[0030] 圖1是設(shè)置不同的整合酶（分別為Ss〇7d-IN、IN以及無 IN對(duì)照組)得出3'加工反應(yīng) 陽性值圖；可以看出Ss〇7d-IN整合酶的活性相較于野生型整合酶有顯著提高，反應(yīng)組3'加 工熒光信號(hào)隨時(shí)間增長(zhǎng)而持續(xù)增加，IN組起始階段隨時(shí)間增加在4h后趨于穩(wěn)定，而無 IN陰 性對(duì)照組的熒光信號(hào)在整個(gè)反應(yīng)過程中無增長(zhǎng)趨勢(shì)。
[0031] 圖2是使用一種二酮酸抑制劑2-(3-氯-4-氟芐基氨基)-7-羥基-6,7-二氫-5H-[1， 7]二氮雜萘-8-酮反應(yīng)3h后對(duì)Sso7d-IN以及野生型IN的抑制效果圖；驗(yàn)證Sso7d-IN是否可 以用來篩選HIV-1整合酶3'加工抑制劑，由圖可以看出其對(duì)IN和Sso7d-IN有相同的趨勢(shì)，抑 制效果相似。表明Ss 〇7d-IN能夠代替IN，對(duì)其他化合物進(jìn)行了篩選，得到的抑制率數(shù)值都已 經(jīng)過修正。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 按如下步驟對(duì)HIV-lSs〇7d-IN整合酶重組蛋白進(jìn)行制備及對(duì)3'加工抑制劑進(jìn)行體 外篩選。以黃芩素(具有抑制IN3'加工且能在細(xì)胞水平抑制病毒復(fù)制)為例：
[0035] (1)將合成的Ss〇7d片段與IN基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到所需質(zhì)粒，以Pet_15b載體為基 礎(chǔ)構(gòu)建出Ss〇7d-IN表達(dá)載體。轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌接種于5mL含 有100mg/mL氨芐的LB液體培養(yǎng)基，37 °C搖床振蕩培養(yǎng)13h得到培養(yǎng)物。
[0036] (2)將（1)中的培養(yǎng)物按體積比1 %接種于LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床振蕩培養(yǎng)2.5h至 菌液0D值達(dá)到0.8，加入過濾滅菌的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.2mM，37 °C 搖床振蕩培養(yǎng)4h得到培養(yǎng)物。
[0037] (3)將（2)中得到的培養(yǎng)物離心得到沉淀，每lg沉淀用10mL裂解緩沖液重懸，加