一種基于rpa的日本血吸蟲核酸檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于RPA的日本血吸蟲核酸檢測(cè)試劑盒 及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血吸蟲病是世界上第二大寄生蟲病，是一種人畜共患的寄生蟲病，流行于亞洲、非 洲和拉丁美洲的76個(gè)國家和地區(qū)，是世界上重要的公共衛(wèi)生問題之一?，F(xiàn)主要存在6種寄生 于人體的血吸蟲，其中我國流行的日本血吸蟲病對(duì)人體健康危害最嚴(yán)重，且防治難度最大。 日本血吸蟲病不僅影響個(gè)人健康，而且影響整個(gè)血吸蟲病流行區(qū)域的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。我國已于 2004年將其列為乙類傳染病，與傳染性非典型肺炎、艾滋病處于同等重要的防治位置。
[0003] 我國的血吸蟲病分布在江蘇、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、廣 西、廣東、福建等12個(gè)省的433個(gè)縣(市、區(qū)），共有釘螺面積148億平方米，累計(jì)感染者達(dá)1160 萬例，受威脅人口在1億以上。經(jīng)過60年的積極防治，全國的血吸蟲病疫情已得到有效控制， 但近年來由于生物、自然、社會(huì)經(jīng)濟(jì)、人口流動(dòng)、政策保障等因素變化較大，一些地方呈現(xiàn)血 吸蟲病疫情擴(kuò)散蔓延的態(tài)勢(shì)，表現(xiàn)為老疫區(qū)血吸蟲病患者增加，釘螺擴(kuò)散明顯，新釘螺區(qū)出 現(xiàn)，感染性釘螺分布范圍擴(kuò)大，部分已達(dá)血吸蟲病傳播控制和傳播阻斷的地區(qū)可能出現(xiàn)疫 情回升，各地輸入性血吸蟲病病例增加，說明我國的血吸蟲病防治工作還任重道遠(yuǎn)。
[0004] 國家對(duì)血吸蟲病的防治非常重視，每年針對(duì)血吸蟲患者及疫水要進(jìn)行大量的資金 投入用于血吸蟲的防控。目前用于血吸蟲診斷的方法主要有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和超 聲診斷等。傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法是診斷血吸蟲病最為可靠、經(jīng)典，是判斷血吸蟲病患病與否 的金標(biāo)準(zhǔn)，尤其Kato-Katz涂片奠檢法以及毛蝴孵育法。Kato-Katz法是從患者奠便中查找 血吸蟲蟲卵，較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且疫區(qū)群眾依從性下降，且易造成漏檢。MHT法包括尼龍袋法、 頂管法、集孵法與促孵法等，該方法檢出率高于常規(guī)方法，但用時(shí)太長(zhǎng)，工作量大，且同樣存 在不能早期診斷和群眾依從性差等問題。免疫診斷方法具有較高的敏感性以及疫區(qū)群眾的 依從性較高等優(yōu)點(diǎn)，已為廣大專業(yè)人員和疫區(qū)群眾所接受，并在對(duì)疫區(qū)化療對(duì)象的大規(guī)模 篩查和血清流行病學(xué)調(diào)查以及防治效果的評(píng)價(jià)等方面起到了極為重要的作用，已形成了皮 試、尾蝴膜試驗(yàn)、環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（C0PT)、間接血凝試驗(yàn)（IHA)、多種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)和直接免疫檢測(cè)等方法。C0PT，對(duì)于非疫區(qū)健康人群具有較高的敏感性和較低的假 陽性率，但對(duì)疫區(qū)的反復(fù)化療的人群其敏感性為72%，這一方法的NPV較高，超過87%，而 PPV較低32%-70%，這一方法費(fèi)時(shí)且相對(duì)復(fù)雜，需要顯微鏡。IHA，仍是社區(qū)診斷常規(guī)的方 法，用于化療人群的篩選，同Kato-Katz法及MHT法相比，其敏感性高，簡(jiǎn)便，快速。然而在反 復(fù)化療的地區(qū)，這一方法的PPV較低，低于37 %，其敏感性從69-100 %，其特異性從35-94%， 此外這一方法同衛(wèi)氏并殖吸蟲有64-84%的交叉反應(yīng)。這限制了其應(yīng)用。ELISA法包括了 Dot-ELISA，SPA-ELISA等，其敏感性從65-100%，但是大多數(shù)報(bào)道的特異性均小于60%， ELISA的NPV較高，超過88%，但是大多數(shù)報(bào)道的PPV非常低。血吸蟲病的超聲診斷是非損傷 性診斷方法，操作簡(jiǎn)便，能準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)肝臟血吸蟲病的病理改變，可評(píng)估病情的嚴(yán)重程度。在 現(xiàn)場(chǎng)短期內(nèi)可檢查大量人群，立即可獲結(jié)果，若使用標(biāo)準(zhǔn)化方法，具有可比性。但是對(duì)于早 期血吸蟲病人無效。
[0005] 疫區(qū)每年都要進(jìn)行大規(guī)模的疫水鑒定、滅螺工作。目前，我國對(duì)疫水的鑒定工作 主要是依靠:①收集釘螺，然后在光照條件充足的情況下孵育出毛蝴鏡檢;②采用"哨鼠"的 辦法判定該水浴是否有尾蝴;③采集牛糞"奠檢"血吸蟲蟲卵。從釘螺中孵育毛蝴對(duì)釘螺的 條件要求高，如果釘螺保存不當(dāng)導(dǎo)致其體內(nèi)寄生的胞蝴死亡或者活力下降，將導(dǎo)致假陰性 的產(chǎn)生；另一方面，鏡檢毛蝴也需要一定的專業(yè)技術(shù)，對(duì)檢驗(yàn)人員要求較高，否則也會(huì)導(dǎo)致 漏檢等。"哨鼠"更是一種耗時(shí)長(zhǎng)且敏感性較低的檢驗(yàn)方法，該方法首選選定水域，然后讓小 白鼠在該水域水面游泳一定時(shí)間（4小時(shí)/天，共2天）；游泳過的小白鼠經(jīng)過6個(gè)周左右的培 養(yǎng)以后，檢測(cè)該小白鼠是否感染血吸蟲，從而來鑒定該水域是否疫水。"哨鼠"方法判定疫水 的工作在時(shí)間上有一種嚴(yán)重的滯后感，往往疫情已過而鑒定結(jié)果卻還沒有出來。
[0006] 相比，血吸蟲病的核酸診斷理論上是最佳的診斷方法，它既可有效地確診血吸蟲 病患者又可對(duì)環(huán)境中的感染因素包括釘螺，疫水及牛糞中是否含有血吸蟲做出判定，目前 已有多種日本血吸蟲的核酸診斷方法包括PCR，Q-PCR以及LAMP等檢測(cè)方法。PCR及Q-PCR法 依賴于熱循環(huán)儀器，對(duì)操作環(huán)境及人員有較高的要求，而LAMP法反應(yīng)目前存在的一大問題 就是其產(chǎn)物對(duì)環(huán)境的嚴(yán)重污染，會(huì)導(dǎo)致陰性對(duì)照產(chǎn)生陽性結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于RPA的日本血吸蟲核酸檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
[0008] 一種基于RPA的日本血吸蟲核酸檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含:RPA凍干顆粒，緩沖 液，醋酸鎂，RPA反應(yīng)引物，RPA反應(yīng)探針。
[0009] 所述試劑盒還包含雙蒸水和日本血吸蟲基因組DNA。
[0010] 所述RPA凍干顆粒包含噬菌體重組酶UvsX，輔助因子UvsY，DNA聚合酶，單鏈DNA結(jié) 合蛋白，dNTPS。
[0011 ]所述緩沖液為Rehydration Buffer。
[0012] 所述RPA反應(yīng)引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2所示。
[0013] 所述RPA反應(yīng)探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
[0014] 一種利用上述基于RPA的日本血吸蟲核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)日本血吸蟲核酸的方 法，包括以下步驟：
[0015] (1)在RPA凍干顆粒中加入29.5yL Rehydration BufTer，2· lyL ΙΟμΜ Primer A， 2.1yL 10μΜ Primer B，0.6yL 10μΜ探針，10.7yL雙蒸水，2.5yL模板，在反應(yīng)管蓋上加醋酸 鎂2.5yL，上下顛倒反應(yīng)管使之充分混勻后離心，放置于TwistDX熒光檢測(cè)器內(nèi)，儀器自動(dòng)升 溫至38°C孵育，在5-20分鐘內(nèi)通過觀測(cè)熒光曲線進(jìn)行結(jié)果判讀；
[0016] (2)結(jié)果判定:含有日本血吸蟲基因組DNA的反應(yīng)管熒光曲線上升，陰性對(duì)照為平 滑的直線；
[0017] 所述Primer A的序列如序列表SEQ ID No. 1所示；所述Primer B的序列如序列表 SEQ ID No. 2所示;所述探針的序列如序列表SEQ ID No.3所示;所述模板為日本血吸蟲基 因組DNA。
[0018] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用RPA技術(shù)建立日本血吸蟲的檢測(cè)方法。這一方法同 現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)相比，其靈敏度與特異性與Q-PCR法相當(dāng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Kato-Katz法、毛蝴孵育 法、ELISA以及IHA。然而Q-PCR需要昂貴的熱循環(huán)儀器，對(duì)環(huán)境及人員要求較高，整個(gè)反應(yīng)需 要90min以上，相比RPA所需儀器輕巧便攜，整個(gè)反應(yīng)時(shí)間在10-20min內(nèi)完成，結(jié)果判定僅需 通過熒光曲線的改變來判定。該檢測(cè)試劑盒具有靈敏，特異，結(jié)果判定簡(jiǎn)便，快捷等優(yōu)點(diǎn)。不 僅適用于床邊診斷而且可以用于現(xiàn)場(chǎng)研究，環(huán)境評(píng)估。
【附圖說明】
[0019] 圖1為實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)1檢測(cè)日