一種兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測(cè)序檢測(cè)堿基連續(xù)突變序列的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種低成本單堿基核酸序列連續(xù)變化的實(shí)時(shí)合成測(cè)序檢測(cè)方法，尤其 涉及一種從可能的多位點(diǎn)變化中確定具體單堿基變化檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 隨著人類基因組計(jì)劃和各種模式生物基因組計(jì)劃的開展和完成，使人類步入了后 基因時(shí)代，對(duì)當(dāng)代的生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了巨大的影響，分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科得到 了迅猛的發(fā)展。從基因水平上認(rèn)識(shí)生命的差異，疾病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，以及藥物與生命體 的相互作用將成為可能。就基因序列分析而言，后基因時(shí)代的重點(diǎn)已由全基因組序列測(cè)定 轉(zhuǎn)移到了對(duì)基因組中個(gè)體遺傳差異及物種間遺傳差異的比較。在諸多基因變異中，突變和 SNP是研究基因遺傳與變異時(shí)一種高效的量化標(biāo)志。通過獲得與該疾病相關(guān)基因信息，對(duì)疾 病預(yù)防、用藥選擇、新藥研發(fā)、疾病預(yù)后等諸多個(gè)體化醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域具有十分關(guān)鍵的影響。因 此，生物科技緊接著面臨如何快速、可靠地對(duì)已知突變和SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的問題，因此，這 將標(biāo)記著巨大的商業(yè)機(jī)會(huì)蘊(yùn)涵在其中，并成為為眾多商家看好的潛在的巨大市場(chǎng)。
[0003] 與為數(shù)有限的蛋白質(zhì)測(cè)序和DNA序列分析方法相比，基因突變(包括SNP)分析的基 本方法在數(shù)量上已達(dá)20余種。種類繁多的分析方法，既反映了研究基因突變(包括SNP)分析 方法在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所受到的重視程度，也反映出任一單個(gè)方法尚無(wú)法滿足后基因時(shí) 代對(duì)基因突變(包括S NP)分析的要求。目前絕極大部分的分析方法均是針對(duì)單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行 分析，對(duì)于間隔很近的連續(xù)多個(gè)變化序列大部分的技術(shù)均無(wú)能為力，而這種堿基連續(xù)變化 的序列數(shù)量也很多。例如Kras基因編碼12、13位點(diǎn)的序列，對(duì)于所有人而言，除了正常序列 外，還有7種突變的序列。然而，對(duì)于具體的一個(gè)人而言，它可能是只有一種正常(未突變)的 DNA序列，或者除了正常(未突變)一種DNA序列外、還有一種突變(七種中可能的一種)DNA序 列。因此，對(duì)一個(gè)具體樣本而言，如何從8種可能的類型中快速、準(zhǔn)確的判斷出具體的分型， 對(duì)于臨床診斷無(wú)疑是有積極意義的?，F(xiàn)有的分析方法中，Sanger測(cè)序無(wú)疑是這類核酸序列 分析的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但在定量分析上對(duì)豐度低于10 %的核酸片段也無(wú)能為力；另外，其相對(duì)復(fù) 雜的操作、儀器及其使用價(jià)格的相對(duì)昂貴也很難進(jìn)行臨床檢測(cè)推廣。DNA芯片組合延伸檢測(cè) 堿基連續(xù)突變的方法（肖鵬峰，等.中國(guó)發(fā)明專利:ZL 201210128598.3)雖然能對(duì)這類序列 進(jìn)行并行分析，但DNA芯片制備耗時(shí)過長(zhǎng)，其總操作時(shí)間超過10小時(shí)，這樣這個(gè)方法只適合 大樣本的科研分析，而不適合快速諸如臨床診斷類的分析。焦測(cè)序技術(shù)是繼Sanger測(cè)序后 的測(cè)序技術(shù)，相對(duì)于Sanger測(cè)序，除了測(cè)序長(zhǎng)度處于弱勢(shì)外，在自動(dòng)化程度，操作簡(jiǎn)易、價(jià)格 上均有優(yōu)勢(shì)，便宜、且檢測(cè)限更低，容易推廣、十分適合臨床檢測(cè)上使用?，F(xiàn)有的焦測(cè)序技術(shù) 原理上如果能夠通過優(yōu)化核苷酸的加入順序，使每種類型具有唯一、特征的測(cè)序圖譜也就 能夠完成對(duì)這類序列的分析。然而，現(xiàn)有焦測(cè)序單個(gè)核苷酸的加入方式一方面由于受到單 體(及其四個(gè)單體試劑倉(cāng))的限制，根據(jù)不同的序列很難優(yōu)化出符合要求的單核苷酸加入順 序，另一方面即使優(yōu)化出符合要求的加入順序，其反應(yīng)次數(shù)也可能很多，增加了分析的費(fèi) 用。
[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)分析堿基連續(xù)突變序列的不足，提出一種兩核苷酸實(shí)時(shí)合成 測(cè)序檢測(cè)堿基連續(xù)突變序列的方法，通過設(shè)計(jì)兩核苷酸加入類型和順序，使每一種具體的 突變類型均有唯一、特征的不同測(cè)序圖譜，從而確定分析樣本的具體突變類型。該方法能夠 通過一次測(cè)序操作將樣本在可能發(fā)生連續(xù)多個(gè)單堿基突變的某個(gè)具體突變確定，簡(jiǎn)化了操 作步驟，減少分析費(fèi)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是:提供一種低成本單堿基核酸序列連續(xù)變化的實(shí)時(shí)合 成測(cè)序檢測(cè)方法，從可能的多位點(diǎn)變化中確定具體單堿基變化。通過設(shè)計(jì)兩核苷酸加入類 型和順序，使每一種具體的突變類型均有唯一、特征的不同測(cè)序圖譜，從而確定分析樣本的 具體突變類型。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：提供一種兩核苷酸實(shí)時(shí)合成 測(cè)序檢測(cè)堿基連續(xù)突變序列的方法，包括如下步驟：
[0007] (1)制備單鏈DNA模板；
[0008] ⑵測(cè)序引物雜交:將測(cè)序引物與單鏈DNA模板結(jié)合；
[0009] (3)利用兩核苷酸對(duì)目的片段進(jìn)行兩核苷酸合成焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，所述的兩核苷 酸為從非標(biāo)記或者標(biāo)記的dATPaS、dCTP、dTTP、dGTP、以及ddATPaS、ddCTP、ddTTP、ddGTP中選 擇的兩種不同的核苷酸，通過設(shè)計(jì)兩核苷酸加入類型和順序，使得每一種具體的突變類型 均有唯一、特征的不同測(cè)序圖譜，然后按照設(shè)計(jì)的兩核苷酸加入類型和順序?qū)Ψ治鰳颖具M(jìn) 行合成測(cè)序；
[0010] (4)每個(gè)測(cè)序反應(yīng)得到的測(cè)序信息包括加入的兩核苷酸信息、以及核苷酸合成的 數(shù)目信息，連續(xù)多個(gè)兩核苷酸合成焦測(cè)序反應(yīng)的測(cè)序信息構(gòu)成測(cè)序圖譜，由測(cè)序圖譜確定 分析樣本的突變類型。
[0011] 所述堿基連續(xù)突變序列是指相鄰位置兩個(gè)或者兩個(gè)以上堿基發(fā)生單堿基序列突 變。
[0012] 所述步驟⑴制備單鏈DNA模板按照如下方法進(jìn)行：
[0013] (Η)采用一個(gè)5 '端修飾生物素的引物對(duì)目的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0014] (1-2)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與鏈霉親和素包裹的磁珠進(jìn)行反應(yīng)，生物素修飾的DNA鏈則 固定到所述磁珠上，得到單鏈DNA模板；
[0015]當(dāng)待測(cè)序列除了含有一種野生型DNA序列外，還含有一種突變型DNA序列時(shí)，選定 兩種序列相同的一個(gè)或者多個(gè)堿基作為一個(gè)峰高的基準(zhǔn)，這個(gè)基準(zhǔn)峰既可以選擇單個(gè)核苷 酸加入、也可以選擇兩個(gè)核苷酸加入的測(cè)序反應(yīng)來確定，通過基準(zhǔn)峰高及每個(gè)反應(yīng)的峰高 值計(jì)算待測(cè)序列中野生型DNA序列與突變型DNA序列的含量。
[0016] 所述的一種兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測(cè)序檢測(cè)堿基連續(xù)突變序列的方法，步驟(3)中不 同dNTPs、ddNTPs合成插入到DNA鏈后釋放出相同的檢測(cè)分子、且釋放出檢測(cè)分子的量與核 苷酸合成的數(shù)目成線性關(guān)系，其檢測(cè)分子是化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的焦磷酸鹽，電化學(xué)檢測(cè)的氫離 子或者光學(xué)檢測(cè)的熒光信號(hào)。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，實(shí)現(xiàn)了分析的序列片段中可能包含多個(gè) 位置的堿基連續(xù)變化的同時(shí)檢測(cè)，快速判斷一個(gè)具體樣本確定樣本是否發(fā)生突變、以及突 變發(fā)生的位點(diǎn)類型。由于一般DNA片段序列除了特定位置的堿基序列不同外，其它序列均為 已知的，因此只需要從幾種可能中判斷出正確序列即可。因此，如果能夠通過設(shè)計(jì)兩核苷酸 加入類型和順序，使每一種具體的突變類型均有唯一、特征的不同測(cè)序圖譜，然后按照設(shè)計(jì) 的兩核苷酸加入類型和順序?qū)Ψ治鰳颖具M(jìn)行合成測(cè)序，比較測(cè)序圖譜、確定突變類型。此 外，本發(fā)明在保持現(xiàn)有基于合成測(cè)序檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性、靈敏度的前提下，能夠快速、簡(jiǎn)單 地實(shí)現(xiàn)不同樣本的并行檢測(cè)。由連續(xù)多個(gè)測(cè)序"峰"構(gòu)成的測(cè)序圖譜不僅能夠?qū)崿F(xiàn)定性分 析，還能夠?qū)崿F(xiàn)定量分析，可以用于低豐度突變DNA序列的分析。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明提供一種兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測(cè)序檢測(cè)堿基連續(xù)突變序列的方法，這里，堿 基連續(xù)突變序列是指序列中相鄰位置兩個(gè)或者兩個(gè)以上堿基發(fā)生單堿基序列突變，由于一 般DNA片段序列除了特定位置的堿基序列不同外，其它序列均為已知的，因此只需要從幾種 可能中判斷出正確序列即可。因此，如果能夠通過設(shè)計(jì)兩核苷酸加入類型和順序，使每一種 具體的突變類型均有唯一、特征的不同測(cè)序圖譜，然后按照設(shè)計(jì)的兩核苷酸加入類型和順 序?qū)Ψ治鰳颖具M(jìn)行合成測(cè)序，比較測(cè)序圖譜、確定突變類型。具體步驟為：（1)制備待測(cè)序列 的單鏈DNA模板；（2)將測(cè)序引物與單鏈DNA模板結(jié)合；（3)對(duì)待測(cè)序列進(jìn)行兩核苷酸合成焦 磷酸測(cè)序反應(yīng)，通過有選擇的幾種具體的兩核苷酸交替加入，完成連續(xù)的多個(gè)兩核苷酸實(shí) 時(shí)合成測(cè)序反應(yīng)。該步驟中，根據(jù)分析樣本所有可能的突變序列，設(shè)計(jì)兩核苷酸加入類型和 順序，使得每一種具體的突變類型均有唯一、特征的不同測(cè)序圖譜，然后按照設(shè)計(jì)的兩核苷 酸加入類型和順序?qū)Ψ治鰳颖具M(jìn)行合成測(cè)序，比較測(cè)序圖譜、確定突變類型。
[0019] 以下將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0020] 實(shí)施例一
[0021]表1是采用本發(fā)明一種兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測(cè)序檢測(cè)堿基連續(xù)突變序列的方法來分 析擬訂序列3 ' -AGCA突變?yōu)?GGCA、CGCA、TGCA、ACCA、AACA、ATCA)設(shè)計(jì)的一種兩核苷酸加入 類型和順序、以及每種具體的突變類型對(duì)應(yīng)的唯一、特征測(cè)序圖譜。表中3'-AGCA為野生型 序列，％CA、0CA、JGCA、A^CA、A^CA、A]；CA為突變型序列(其中下劃線字母表示突變堿基）。而 一個(gè)?體的分析#本要么只含有一種野生型DNA序列，或者除了含有一