列中缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基、或者將序列中的一 個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基替換成另外的核苷酸殘基，例如將A替換成T，將C替換成G等。本領(lǐng)域技 術(shù)人員清楚，所述修飾形式的引物也涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)、特別是權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR引物和測序引物的核苷酸序列的修飾形式為如CN103270174A中所 公開的化學(xué)增強(qiáng)型引物。
[0046] 可以使用例如通用DNA合成儀(例如由Applied Biosystems制造的394型），經(jīng)化學(xué) 方法合成本發(fā)明引物中的各個(gè)核苷酸。還可采用本領(lǐng)域眾所周知的任何其它方法來合成寡 核苷酸，例如PCR引物和測序引物。
[0047]使用從樣品中提取的基因組DNA作為模板，并使用PCR引物對乙型肝炎病毒(HBV) 耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增反應(yīng)包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCP)、自動維持序列復(fù)制（3SR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈置換擴(kuò) 增（SDA)、多重置換擴(kuò)增(MDA)和滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，其公開于以下參考文獻(xiàn)(在此引作參考） 中：Mull is等，美國專利第4,683,195 號；第4,965,188號；第4,683,202 號；第4,800,159 (PCR)號;Gelfand等，美國專利第5,210,015號（用"Taqman"或"Taq" [注冊商標(biāo)]探針進(jìn)行 的實(shí)時(shí)PCR);Wittwer等，美國專利第6，174,670號；1(&(^ &11等，美國專利第5,399,491號 ("NASBA"）； Lizardi，美國專利第5，854，033號;Aono等，日本專利公開第JP 4-262799號（滾 環(huán)擴(kuò)增）；等等。
[0048]優(yōu)選使用PCR法對靶核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。PCR法本身是本領(lǐng)域眾所周知的。術(shù)語"PCR" 包括該反應(yīng)的衍生形式，其包括但不限于反轉(zhuǎn)錄PCR、實(shí)時(shí)PCR、嵌套式PCR、多重PCR和熒光 定量PCR等。優(yōu)選使用熒光定量PCR法對靶核苷酸進(jìn)行定量擴(kuò)增。
[0049]在引物、模板DNA和耐熱DNA聚合酶存在下，使用與有義鏈雜交的引物(反向引物） 和與反義鏈雜交的引物(正向引物），通過使變性、退火和延伸步驟的循環(huán)重復(fù)大約30次~ 60次(例如50次)來進(jìn)行PCR。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR為實(shí)時(shí)熒光定量PCR。在一個(gè)實(shí)施方案 中PCR使用了引物組1和/或2。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，也可使用其它PCR法和引物 組，只要可擴(kuò)增出目標(biāo)片段即可。
[0050] 在本發(fā)明的PCR中，可使用各種常規(guī)的耐熱DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，包括但不限于 FastStart Taq DNA聚合酶（Roche)、Ex Taq (注冊商標(biāo)，Takara)、Z_Taq、AccuPrime Taq DNA聚合酶和HotStarTaq Plus DNA聚合酶。
[0051] 基于引物Tm值選擇合適PCR反應(yīng)條件的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員可以根據(jù)引物長度、GC含量、目標(biāo)特異性和靈敏度、所使用的聚合酶性質(zhì)等，選出最 佳條件。例如，可使用以下條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng):95°C 15分鐘，95°C 15秒，58°C 20 秒，72°C 30秒，循環(huán)50次。反應(yīng)體系為40yL。
[0052] 在獲得PCR產(chǎn)物后，可對PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，以獲得與測序引物互補(bǔ)結(jié)合的單鏈PCR 產(chǎn)物。單鏈PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生和純化可通過本領(lǐng)域周知的方法來進(jìn)行。常見的產(chǎn)生和純化單鏈 PCR產(chǎn)物的方法包括但不限于T7逆轉(zhuǎn)錄法(Hughes等人，Nat. Biotechnol·，2001，19: 342-347)、核酸外切酶法(Higuchi和Ochman, Nucleic. Acids Res·, 1989，17:5865)、變 性高效液相色譜法（denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC) (Dickman和Hornby, Anal. Biochem·，2000，284:164-167)和磁珠捕獲法（Espelund等 人，Nucleic. Acids Res.，1990，18:6157-6158)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明通過磁 珠捕獲法獲得與測序引物互補(bǔ)結(jié)合的單鏈PCR產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明通過 PyroMark ? Q24真空工作站按照制造商的說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，以獲得與測序引物 互補(bǔ)結(jié)合的單鏈PCR產(chǎn)物。
[0053] 另外，也可使用不對稱PCR方法直接制備單鏈PCR產(chǎn)物，從而省去了在PCR后進(jìn)行額 外的處理。不對稱PCR可在PCR擴(kuò)增的同時(shí)制備DNA單鏈。常規(guī)不對稱PCR使用兩條不等量的 引物，在開始的循環(huán)里進(jìn)行正常擴(kuò)增。隨著循環(huán)的增加，量少的引物被逐漸耗盡，而超量的 引物可繼續(xù)直線擴(kuò)增生成DNA單鏈（Gyllensten 和Erlich，Proc·Natl·Acad·Sci· U.S.A.， 1988， 85:7652-7656)。
[0054] 在獲得單鏈PCR產(chǎn)物后，可采用本發(fā)明的測序引物進(jìn)行焦磷酸測序。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明的測序引物包含或具有至少一個(gè)(例如至少2、3、4、5或全部6個(gè))選自以下的核 苷酸序列：SEQ ID N0: 3、7、11、17、21和25。當(dāng)本發(fā)明的測序引物包含或具有選自SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25的2、3、4、5或全部6個(gè)核苷酸序列時(shí)，這意指選自SEQIDN0:3、7、 11、17、21和25的2、3、4、5或全部6個(gè)測序引物組合使用以檢測多個(gè)靶基因的耐藥性，例如包 含或具有SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的測序引物與包含或具有SEQ ID NO: 7、11、17、21 和/或25的核苷酸序列的測序引物組合使用。
[0055] 本發(fā)明的測序引物可以任意組合，以針對樣品中的不同靶基因進(jìn)行測序，例如SEQ ID N0: 3可與SEQ ID N0: 7、ll、17、21和/或25組合，SEQIDN0:7可與SEQIDN0:3、ll、 17、21和/或25組合，SEQ ID NO: 11可與SEQ ID NO: 3、7、17、21和/或25組合，以此類推。因 此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的測序引物可包含或具有選自SEQ ID N0: 3、7、11、17、21和 25之一的核苷酸序列，并任選包含或具有選自SEQ ID N0: 3、7、11、17、21和25的另外一個(gè)、 另外兩個(gè)、另外三個(gè)、另外四個(gè)或全部另外五個(gè)的核苷酸序列;例如本發(fā)明的測序引物可包 含SEQ ID N0: 3的核苷酸序列以及任選包含至少一個(gè)(例如至少2、3、4或全部5個(gè))選自SEQ ID N0: 7、11、17、21和25的核苷酸序列；本發(fā)明的測序引物可包含SEQIDN0:7的核苷酸 序列以及任選包含至少一個(gè)(例如至少2、3、4或全部5個(gè))選自SEQ ID NO: 3、11、17、21和25 的核苷酸序列;等等。
[0056]本發(fā)明一方面涉及用于基于焦磷酸測序技術(shù)檢測乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突 變的測序引物組，所述測序引物組包括： 包含或具有選自SEQ ID N0: 3、7、11、17、21和25之一的核苷酸序列的測序引物，和 包含或具有選自SEQ ID N0: 3、7、11、17、21和25的另外一個(gè)、另外兩個(gè)、另外三個(gè)、另 外四個(gè)或全部另外五個(gè)的核苷酸序列的測序引物。
[0057]本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，當(dāng)各測序引物組合使用時(shí)，所使用的PCR引物、靶 基因、待分析序列、分配順序和靶序列根據(jù)下文表3的對應(yīng)關(guān)系也相應(yīng)地組合使用。例如當(dāng) SEQ ID N0: 3的測序引物與SEQ ID N0: 7、11、17、21和/或25的測序引物組合使用時(shí)，卩0? 引物組1與PCR引物組2組合使用，由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所 示的分配順序與由SEQ ID NO: 8所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 9所示的分配順序、由 SEQ ID NO: 12所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 13所示的分配順序、由SEQ ID NO: 18 所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 19所示的分配順序、由SEQ ID NO: 22所示的待分析序 列和由SEQ ID NO: 23所示的分配順序、和/或由SEQ ID NO: 26所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 27所示的分配順序組合使用。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施方案中，采用QIAGEN公司的PyroMark Gold Q24 Reagents試劑盒和實(shí) 時(shí)定量焦磷酸序列分析儀(型號:PyroMark ? Q24 MDx)，按照說明書方法進(jìn)行焦磷酸測序。 可使用以下雜交條件進(jìn)行焦磷酸測序:80 °C加熱1.5min，室溫退火20分鐘。在一個(gè)實(shí)施方案 中，焦磷酸測序還使用至少一種