一種豬偽狂犬病毒變異毒株的pcr鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物毒株鑒別技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR 鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)是皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科的雙股DNA 病毒，基因組在140kd左右，編碼69個(gè)開放閱讀框。該病毒主要引起母豬流產(chǎn)、死胎及呼吸系 統(tǒng)癥狀，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，歐美洲很多國(guó) 家通過免疫接種和凈化技術(shù)已經(jīng)根除該病。我國(guó)近十多年內(nèi)通過采用強(qiáng)化免疫和凈化技 術(shù)，該病也得到有效控制。但是，2011年末，我國(guó)PRV疫苗免疫豬場(chǎng)再次暴發(fā)該病。全基因組 分析結(jié)果也表明，此次新發(fā)的偽狂犬病病毒與之前的經(jīng)典偽狂犬病毒屬于不同的亞群，其 抗原性發(fā)生了變化，變異毒株位于一個(gè)新的基因分支。因此建立PRV變異毒株和經(jīng)典毒株鑒 別方法十分必要。
[0003] 目前現(xiàn)有的檢測(cè)偽狂犬病毒感染的PCR方法有很多，其中最常用的兩種是國(guó)標(biāo)法 與偽狂犬gE基因檢測(cè)法。國(guó)標(biāo)法主要針對(duì)偽狂犬病毒gD基因，可以特異的擴(kuò)增出220bp的片 段。因?yàn)間D基因是偽狂犬病毒感染過程中一個(gè)重要的囊膜蛋白，包括疫苗毒與野毒在內(nèi)的 各種類型的偽狂犬病毒(gD缺失的偽狂犬病毒除外)都存在該基因，所以該方法可以用于鑒 別偽狂犬病毒的感染與否，但不能夠區(qū)分疫苗毒與野毒株。而偽狂犬病毒gE基因檢測(cè)法主 要用于鑒別疫苗毒與野毒株，野毒株可以擴(kuò)增出632bp的片段，而疫苗毒由于缺失了 gE基 因，所以不能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段。因?yàn)楝F(xiàn)階段豬場(chǎng)都有Bartha-K61等疫苗免疫，所以國(guó)標(biāo)方 法不再適合進(jìn)行鑒別，而用于區(qū)分疫苗毒與野毒的偽狂犬病毒gE基因檢測(cè)法得到了很好的 應(yīng)用，但是由于偽狂犬病毒變異毒株的出現(xiàn)，使這一方法受到了局限。該方法不能夠區(qū)分出 變異毒株與經(jīng)典毒株，而變異毒株與經(jīng)典毒株的區(qū)分在免疫與監(jiān)測(cè)上又至關(guān)重要，所以需 要一種可以有效區(qū)分偽狂犬病毒經(jīng)典毒株與變異毒株的PCR診斷方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了有效的預(yù)控偽狂犬病的發(fā)生，區(qū)分出經(jīng)典毒株與變異毒株的感染及其流行的 區(qū)域至關(guān)重要。本研究通過不同毒力毒株全基因組序列比對(duì)，找到了經(jīng)典毒株與變異毒株 的基因差異區(qū)域UL44和UL36,設(shè)計(jì)PCR引物，建立了兩步法PCR，具有較高特異性和敏感性， 可用于鑒別PRV經(jīng)典毒株與變異毒株，為該病診斷提供了有效方法。
[0005] 本發(fā)明是通過以下步驟得到的：
[0006] -種豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR鑒別方法，提取待鑒別病毒DNA，使用引物1F-C、 1F-V、1R進(jìn)行第一步擴(kuò)增，擴(kuò)增出兩條條帶的為變異株或HB98疫苗毒株，擴(kuò)增出1條條帶的 為經(jīng)典毒株;擴(kuò)增出兩條條帶的病毒DNA再使用引物2F和2R進(jìn)行第二步擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分子 量大小為293bp的為變異株，擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為239bp的為HB98疫苗毒株；
[0007] 引物卟-(：、卟，、11?、2?和21?序列如下：
[0008] 1F-C:5 '-GAGCCCGTCTCGGGGACGAC-3 '，
[0009] 1F-V:5 '-GCTGCTCGAGGCGGACCACGTC-3 '，
[0010] 1R:5 '-CCGGTGCGCGTGCCTGTGG-3 '，
[0011] 2F:5 '-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3 '，
[0012] 2R:5 '-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3 '。
[0013] 通過對(duì)中國(guó)新流行偽狂犬病毒變異毒株與國(guó)內(nèi)外經(jīng)典毒株全基因組序列比對(duì)發(fā) 現(xiàn)，在UL44區(qū)域內(nèi)，變異毒株比經(jīng)典毒株多插入了21個(gè)堿基的序列。鑒此，首先設(shè)計(jì)了3條引 物的PCR方法，一條下游引物，兩條上游引物。理論上，經(jīng)典毒株只能與一條上游引物和下游 引物結(jié)合，產(chǎn)生一條約840bp的條帶;而變異毒株(包括HB98)可以與兩條上游引物和下游引 物結(jié)合，產(chǎn)生一條約840bp的條帶和一條450bp左右的條帶。由此可以區(qū)分出偽狂犬病毒經(jīng) 典毒株與變異毒株。但是實(shí)際操作過程中，與變異毒株結(jié)合的兩條上游引物存在著一定程 度的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，840bp的條帶比450bp條帶要亮，我們通過很大程度的減少1F-C，增加1F-V， 緩解了這一問題，但是由于相比較1F-V，1F-C的量很少，有的時(shí)候變異毒株只能擴(kuò)增出 450bp的條帶。即便是這樣，也可以區(qū)分出經(jīng)典毒株與變異毒株。但是，我們?cè)跈z測(cè)疫苗毒株 時(shí)發(fā)現(xiàn)，HB98毒株也出現(xiàn)兩條條帶，基因序列測(cè)定結(jié)果顯示，HB98毒株UL44也存在著21個(gè)堿 基的插入。我們?cè)赨L36區(qū)域內(nèi)又設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，通過第二次PCR，HB98擴(kuò)增出293bp條帶， 變異毒株擴(kuò)增出239bp的條帶，從而可以有效區(qū)分HB98與變異毒株，結(jié)果證明，通過以上兩 次PCR可以有效地區(qū)分偽狂犬變異毒株與經(jīng)典毒株。
[0014] 所述的PCR鑒別方法，優(yōu)選第一步PCR反應(yīng)體系:Taqmix 12·5μ1，0·1μ1 rTaq，蒸餾 水1.5yl，DMS0 2.5μ1，10ιιΜ的上游引物1F-C、下游引物1F-V、鑒別引物1R分別為0.5μ1、2μ1、 5以1，0嫩模板]^1。
[0015] 所述的PCR鑒別方法，優(yōu)選第一步PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，70 。(:退火308,72°(：延伸1111丨11，10個(gè)循環(huán)；65°(：退火308,72°(：延伸1111丨11，10個(gè)循環(huán) ；60°(：退火 30s，72°C延伸lmin，15個(gè)循環(huán);最后72°C終延伸lOmin。
[0016] 所述的PCR鑒別方法，優(yōu)選第二步PCR反應(yīng)體系：Taqmix 12 · 5μ1，蒸餾水6 · 5μ1， DMSOlyl，10uM上游引物F'、下游引物R'分別為2μ1、2μ1，DNA模板ΙμL。
[0017] 所述的PCR鑒別方法，優(yōu)選第二步PCR反應(yīng)條件：95 °C預(yù)變性5min; 95 °C變性30s，68 。(:退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán);最后72°C終延伸lOmin。
[0018] 所述的PCR鑒別方法，第一步PCR的敏感度達(dá)到2-20TCID5Q病毒量或0.5ng/ml質(zhì)粒 量。
[0019] 所述的PCR鑒別方法，第二步PCR敏感度達(dá)到50TCID5Q病毒量或者100ng/ml質(zhì)粒量。
[0020] 所述的PCR鑒別方法，準(zhǔn)確率達(dá)到91 %到100 %。
[0021]區(qū)分經(jīng)典毒株與變異毒株的原則是:第一次PCR，如果擴(kuò)增產(chǎn)物只有836bp-個(gè)條 帶，則為經(jīng)典PRV毒株，如果擴(kuò)增產(chǎn)物含有836bp和466bp兩個(gè)條帶，則為變異毒株或HB98疫 苗毒株。如果出現(xiàn)兩個(gè)條帶，則需要進(jìn)行第二步PCR。如果第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為293bp， 則為變異毒株，如果擴(kuò)增產(chǎn)物大小為239bp，則為HB98疫苗毒株。該判斷方法簡(jiǎn)便易行。 [0022]本發(fā)明的有益效果：
[0023] 1)第一步PCR的敏感度可以達(dá)到2-20TCID5Q病毒量或0.5ng/ml質(zhì)粒量，而第二步 PCR敏感度達(dá)到50TCID5Q病毒量或者100ng/ml質(zhì)粒量。該敏感度可以有效的檢測(cè)出臨床病料 中是否有偽狂犬病毒感染，并區(qū)分出偽狂犬病毒經(jīng)典毒株或者變異毒株感染；
[0024] 2)通過與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法和常規(guī)的PCR方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在28份病料中，國(guó)標(biāo)方法 可以檢測(cè)出22份陽(yáng)性，常規(guī)PCR方法可以檢測(cè)出20份陽(yáng)性，本方法可以檢測(cè)出20份陽(yáng)性(20 份均屬于變異毒株），與前兩種方法的符合率達(dá)到了 91%與100%且很好的區(qū)分出變異毒株 與經(jīng)典毒株。所以該方法可以廣泛用于臨床病原的檢測(cè)、監(jiān)控與流行病學(xué)調(diào)查。
【附圖說明】
[0025] 圖1為經(jīng)典毒株與變異毒株UL44區(qū)段的擴(kuò)增，M，DL2000 DNA marker;l，變異毒株 ZJ01; 2，經(jīng)典疫苗毒株HB98; 3，經(jīng)典野毒株LA; 4，經(jīng)典疫苗毒株Bartha-K61; 5，經(jīng)典疫苗毒 株Bucharest; 6，陰性對(duì)照；
[0026] 圖2為HB98與偽狂犬變異毒株ZJ01 的區(qū)分，M，DL2000 DNA marker;l，ZJ01 株；2， HB98株;3,陰性對(duì)照；
[0027] 圖3為第一步PCR特異性試驗(yàn)，M，DL2000 DNA Marker;l，豬圓環(huán)病毒2型；2,豬繁殖 與呼吸綜合征病毒;3,豬瘟病毒;4,日本乙型腦炎病毒;5,腦心肌炎病毒;6,豬流行性腹瀉 病毒;7,陰性對(duì)照;8,豬偽狂犬病毒ZJ01株;9,豬偽狂犬病毒LA株；
[0028] 圖4第二步PCR特異性試驗(yàn)，M，DL2000 DNA Marker;l，豬圓環(huán)病毒2型；2,豬繁殖與 呼吸綜合征病毒;3,豬瘟病毒;4,日本乙型腦炎病毒;5,腦心肌炎病毒;6,豬流行性腹瀉病 毒;7,陰性對(duì)照;8,豬偽狂犬病毒ZJ01株;9,豬偽狂犬病毒HB98株；
[0029]圖5第一步PCR鑒別PRV經(jīng)典毒株（LA株）與變異毒株（ZJ01株）的敏感性試驗(yàn)。M: DL2000 DNA marker; 1，20000TCID5Q; 2，2000TCID5Q; 3，200TCID5Q; 4，20TCID5Q; 5，2TCID50; 6， 陰性對(duì)照；
[0030] 圖6第二步PCR方法鑒別PRV變異株和HB98的敏感性試驗(yàn)，M，DL2000 ; 1， 50000TCID5。； 2，5000TCID5。； 3，500TCID5。； 4，50TCID5。； 5，5TCID5。； 6，0 · 5TCID5。； 7，陰性對(duì)照；
[0031] 圖7含UL44基因的重組質(zhì)粒DNA敏感性試驗(yàn)，M，DL2000 DNA marker;l，50000ng/ ml;2，5000ng/ml;3，500ng/ml;4,50ng/ml;5，5ng/ml;6，0·5ng/ml;
[0032] 圖8含UL36基因的重組質(zhì)粒DNA敏感性試驗(yàn)，M，DL2000 DNA marker;l，105ng/ml; 2，104ng/ml; 3，103ng/ml; 4，102ng/ml; 5，10ng/ml; 6，陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明：
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 1材料和方法
[0036] 1.1試劑和儀器
[0037] TaqMix購(gòu)自諾唯贊公司，rTaq購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，DMS0購(gòu)自Sigma公 司。引物合成自南京金斯瑞公司。PCR儀購(gòu)自eppendorf公司。病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司。
[0038] 1.2病毒和病料
[0039] 病毒:PRV變異毒株ZJ01株(本實(shí)驗(yàn)室于2011年分離鑒定），PRV傳統(tǒng)毒株LA株（中國(guó) 動(dòng)物疫病衛(wèi)生中心范偉興研究員提供），HB98疫苗毒株（武漢科前公司PRV商品疫苗）， Bartha-K61毒株(梅里亞公司PRV商品疫苗），Bucharest毒株(美國(guó)輝瑞公司PRV商品疫苗）。
[0040] 臨床病料:來自華東地區(qū)發(fā)病豬群，腦或肺臟組織懸液共28份，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0041] 1.3引物設(shè)計(jì)與合成
[0042] 根據(jù)Genebank PRV基因組序列（ZJ01、TJ、Bartha_K61、Becker、Kaplan)與本實(shí)驗(yàn) 室偽狂犬經(jīng)典毒株LA基因序列（尚未發(fā)表），采用DNAstar和BioEdit軟件比