一種蘋果莖溝病毒檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種蘋果莖溝病毒檢測(cè)試劑 盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果為世界四大水果之一，分布廣泛，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國已有兩千多年 的栽培歷史。目前，我國蘋果樹栽培面積和總產(chǎn)量均居世界第一，但生產(chǎn)水平和果品質(zhì)量仍 與先進(jìn)國家存在相當(dāng)差距，其影響因素很多，病毒病的危害是造成這一現(xiàn)象的重要原因之 一。蘋果病毒病在世界各地廣泛分布，影響嚴(yán)重，具有危害性強(qiáng)、傳播擴(kuò)散快和難以治愈的 特點(diǎn)。樹體受到病毒危害后，病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)寄生并增殖，破壞干擾樹體的正常生理機(jī) 能，嚴(yán)重影響果樹的生長，降低產(chǎn)量、品質(zhì)、果品的耐貯藏性和耐運(yùn)力，也影響蘋果根系對(duì)土 壤營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)是常見的潛隱性病毒之一，危 害蘋果、梨、柑橘、櫻桃、杏等果樹，可通過種子、嫁接、機(jī)械接種、汁液摩擦等方式感染宿主， 迄今尚未發(fā)現(xiàn)其傳播媒介。被蘋果莖溝病毒侵染的果樹植株表現(xiàn)出嫁接部位壞死，葉片不 同程度變黃，后期出現(xiàn)大塊黑斑或卷葉等癥狀，病株較健康株生長矮小并衰弱。由于其癥狀 與其他常見病毒感染相比并無典型性，因此容易被忽視。
[0004] 蘋果莖溝病毒是發(fā)形病毒屬(Capillovirus)的代表性成員，其基因組有兩個(gè)0RF: 0RF1編碼分子量241KDa的多聚蛋白，CP位于其C端，大小為27KDa; 0RF2位于0RF1內(nèi)部，編碼 分子量為36KDa的運(yùn)動(dòng)蛋白，運(yùn)動(dòng)蛋白與外殼蛋白部分基因重疊。目前對(duì)蘋果莖溝病毒的檢 測(cè)，多采用傳統(tǒng)生物學(xué)方法、血清學(xué)方法以及分子生物學(xué)方法。然而，傳統(tǒng)方法耗時(shí)長，靈敏 度不高，特異性差;血清學(xué)方法費(fèi)用昂貴，操作步驟多，耗時(shí)較長，且樣品中可能存在與抗體 發(fā)生非特異性反應(yīng)的雜質(zhì)，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此只適合于初篩;而分子生物學(xué)方法由于 其特異性強(qiáng)、靈敏度高，是現(xiàn)今應(yīng)用最多的處于研究前沿的方法。為了適應(yīng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求， 有必要開發(fā)一種能夠更加快速、準(zhǔn)確地對(duì)蘋果莖溝病毒進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)的方法。
[0005] 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些 年發(fā)展起來的一種新型的核酸擴(kuò)增方法（見文獻(xiàn)Notomi T，0kayama H，Masubuchi Η, Yonekawa T,ffatanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15;28(12):E63)。而逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA檢測(cè)技術(shù)，其靈敏度是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP擴(kuò)增 原理與LAMP相同，但在反應(yīng)體系中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，使RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的LAMP擴(kuò)增在同 一試管中一步完成。與常規(guī)PCR相比，RT-LAMP無需模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀 察等過程，短時(shí)間內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)大量拷貝數(shù)的核酸擴(kuò)增，且無需高端的儀器設(shè)備，具有特異性 強(qiáng)、靈敏度高、易于判讀、可定性定量等優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種蘋果莖溝病毒檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種蘋果莖溝病毒檢測(cè)試 劑盒，其特征在于包括4條特異性引物:外引物F3，其序列如SEQ ID NO: 1所示;外引物B3，其 序列如SEQ ID N0:2所示；內(nèi)引物FIP，其序列如SEQ ID N0:3所示；內(nèi)引物BIP，其序列如SEQ ID N0:4所示。引物序列具體如下：
[0008] 外引物F3:TGTTCCTGAATTGAAAACCTT(SEQ ID N0:1)
[0009] 外引物B3:CAAAGTCAAATGCAACCCA(SEQ ID N0:2)
[0010] 內(nèi)引物FIP:TCGGCAAAAGGCTCACAAAG-TACTTCTAGGCAAAATTCTTTGAAC(SEQ ID N0:3)
[0011] 內(nèi)引物BIP:CTGGCACGTGAATTTCTTCATGA-TTCTCAAATGCTTTGGGC(SEQ ID N0:4)。
[0012] 優(yōu)選所述外引物F3和B3的濃度均為5pm〇lAU，所述內(nèi)引物FIP和BIP的濃度均為 40ρηιο1/μ1 〇
[0013] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還可以包括反應(yīng)緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶 和核酸染料，其中所述反應(yīng)緩沖液由10mM (1階？、10\1116^11〇?〇1反應(yīng)緩沖液、511^甜菜堿和 50mM MgS〇4組成。
[0014] 優(yōu)選所述核酸染料為SYBR Green I。
[0015] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還可以包括RNA提取試劑以及陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0016] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明還提供了一種蘋果莖溝病毒檢測(cè)方法，其利用RT-LAMP技 術(shù)，包括以下步驟：
[0017] (1)提取待測(cè)樣品RNA;
[0018] (2)設(shè)計(jì)并合成引物；
[0019] (3)建立25μ1的RT-LAMP反應(yīng)體系，其包括5ρ??〇1/μ1的外引物F3 1μ1、5ρ??〇1/μ1的 外引物Β3 1μ1、40ρπιο1/μ1的內(nèi)引物FIP 1μ1、40ρπιο1/μ1的內(nèi)引物ΒΙΡ ΙμL、反應(yīng)緩沖液2.5μ 1、2U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶lyl、8U Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水補(bǔ)充至25μ1，并以蘋果莖 溝病毒基因組DNA作為陽性對(duì)照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作為陰性對(duì)照；
[0020] (4) LAMP反應(yīng):將步驟(3)中PCR管于63 °C恒溫反應(yīng)60min;
[0021] (5)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果:在(4)中所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入ΙμL核酸染料，根據(jù)反應(yīng) 液的顏色判斷是否存在蘋果莖溝病毒。
[0022]在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，所述外引物F3的序列如SEQ ID NO: 1所示，外引物Β3的序 列如SEQ ID N0:2所示，內(nèi)引物FIP的序列如SEQ ID N0:3所示，內(nèi)引物BIP的序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0023] 優(yōu)選所述反應(yīng)緩沖液由l〇mM (1犯1\10\1116這〇?〇1反應(yīng)緩沖液、51111甜菜堿和5〇111]\1 MgS〇4組成。
[0024]優(yōu)選所述核酸染料為SYBR Green I，如反應(yīng)液顏色為橙色，表示結(jié)果為陰性，待測(cè) 樣品中不含ASGV;如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽性，待測(cè)樣品中含有ASGV。
[0025]本發(fā)明的蘋果莖溝病毒檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法利用RT-LAMP技術(shù)，針對(duì)ASGV的CP 區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，其識(shí)別ASGV的6個(gè)特定區(qū)域，特異性和靈敏度更高。反應(yīng)在等溫 (63°C)條件下進(jìn)行，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器，一步完成逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟，假陽性率 低、快速、高